DNA的限制性内切酶酶切

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实验目的
1. 学会DNA限制性内切酶 酶切技术。
2. 琼脂 糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。

实验原理
质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列G↓GATCC，用BamHI酶切后形成线性质粒DNA。琼脂 糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小，必须用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是lDNA/Eco RI、lDNA/Hind III、lDNA/Eco RI+Hind III的酶切片段


实验材料和试剂
（一）实验材料
实验二提取的质粒 pUC118
（二）试剂
1．限制性内切酶 BamHI
2．l DNA/Hind III分子量标准
3．双蒸馏无菌水
4．溴酚蓝指示剂点样缓冲液
5．1mg/ml溴化乙锭溶液
6．电泳缓冲液（TAE）
7．0.7% 琼脂糖凝胶（用TAE电泳缓冲液配制）

（三）器材
1.5ml Eppendorf管 200ml吸头
（四）仪器
微量移液器 离心机
恒温水浴锅 电泳仪
水平电泳槽 透射紫外观察仪

实验步骤
1. 取一个灭菌的Eppendorf管，依次加入下列试剂：
双蒸馏无菌水 12ml
10×Bam HI缓冲液 2ml
质粒pUC118 5ml

BamHI 1ml
总体积 20ml
2. 用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。
3. 置37℃水浴60～120 分钟。
4. 加入5ml溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果，鉴定酶切效果。

【提示】
实验操作中注意的问题
1. 酶切反应用的Eppendorf管和吸头，都要用新的，用双蒸馏水洗净，灭菌。使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染。
2．DNA样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
3．要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶。
4．取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。
5．当样品在37℃保温时，要将Eppendorf管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密使水进入管内，造成实验失败。