双向电泳细胞样品与组织样品处理方法

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一、培养细胞(culture Cell )样品处理方法：

培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液(Lysis buffer)抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：

1. 7M Urea，2M Thiourea，4%(w/v)CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2% Pharmalyte pH 3-10.

其他常用的裂解缓冲液如下：

2. 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

3. 加入 0.3-1% SDS 在 95 C 煮样品 5mins，冷却后加入至少 5倍体积的(A)或(B)裂解液。

总蛋白抽提程序：

1. 培养细胞的收集;

2. 用磷酸缓冲液(PBS )洗细胞 3 次(室温，1000g，各 2min);

3. 将细胞分装到 1.5ml Eppendof管中，吸干残留的 PBS ;

5. 4 C，40,000g，离心 1h;

6. 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78℃备用。

二、组织样品处理方法：

对大多数从动物或植物 组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

三氯醋酸-丙酮沉淀法(TCA/acetone precipitation)提取植物 树叶总蛋白程序：

1.在液氮中研碎叶片;

2. 悬浮于含 10%三氯醋酸(TCA)和 0.07%β-巯基乙醇(可用 DTT替代)的丙酮溶液在-20℃ 的冰浴;

3.让蛋白质沉淀过夜然后离心(4 C，40,000g, 1h)，弃上清;

4. 重悬沉淀浮于含 0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里;

5. 离心(4 C，40,000g, 1h)后真空干燥沉淀;

6.用(A)或(B)裂解液溶解沉淀，离心(4 C，40,000g, 1h)。

7. Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78℃备用。

超速离心法：

1. 取材;

2. 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s;

3. 组织悬液15℃，10 000×g离心10 min;

4. 上清液4℃，150 000×g超速离心45 min;

5. 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min;

6. 取离心上清。Bradford法定量，分装后置-75℃保存。