双向电泳

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化。双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10000个斑点（spot）。当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。

样品制备（sample prepareation）和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率。用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用。对IEF（isoelectric focusing）样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质。理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理。而离液剂2mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG（immobilized pH gradients）胶上的转换。三丁基膦（Tributyl phosphine，TBP ）取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加]。两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效。在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸（DNA）。除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎]等。另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性。由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]。此外，低丰度蛋白（low abundance protein）在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战。亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量（已达到1~15 mg级的标准）、应用敏感性检测，可以提高其敏感性。如一种多肽免疫2-DE印迹（MI-2DE）是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测。提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白（basic proteins）的分离是另一难点。由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流（EOF）的产生，对PI（等电点）超过10的碱性蛋白，通过产生0~10%的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之。亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性。

2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性。高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比（match）。对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1）ISO-DALT（isoelectric focus）以O’Farrell’s技术为基础。第一向应用载体两性电解质（carrier ampholyte，CA），在管胶内建立pH梯度。随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移。2）NEPHGE（non-equilibrium pH gradient electrophoresis）用于分离碱性蛋白（pH>7.0）。如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失。因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制。3）IPG-DALT发展于80年代早期。由于固相pH梯度（Immobilized pH gradient，IPG）的出现解决了pH梯度不稳的问题。IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性。目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度。新的酸性pH 3~5或碱性pH 6~11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 4~7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群（proteomic contigs）从而有效分离。

分离后的斑点检测（spot detection）亦很重要。所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的。此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性。目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术。银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2~5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感。多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜。放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测。另有一种改良的2-DE（差异凝胶电泳），即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测。

较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术。