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PCR 基础

聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组 或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。

表1. 反应成分 ComponentFinal ConcentrationTemplate10^4-10^6 copies of DNA templatePrimer 10.1-0.5µMPrimer 20.1-0.5µM10X Reaction buffer1XMagnesium1.0-3.0mMdNTP mix200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase1-4 units/100 ml reaction

RT-PCR 基础

RT-PCR 将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR 的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

图1. RT-PCR概图