丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

PCR及RT

互联网

2673
相关专题
 

1. 问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂 糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因:
1)RNA被降解
建议解决方法:
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;
在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;
如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
2)RNA中包含逆转录 抑制剂
建议解决方法:
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA ,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3)多糖同RNA共沉淀
建议解决方法:
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法:
确定退火温度 适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5)起始RNA量不够
建议解决方法:
增加RNA量。
对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA
6)RNA模板二级结构太多
建议解决方法:
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法:
在PCR前用RNaseH处理。
8)靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法:
尝试其他靶序列或组织
9)PCR没有起作用
建议解决方法:
对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

2.问题:PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因:
1)PCR引物设计较差
建议解决方法:
避免在引物3"端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
2)DNA含有抑制剂
建议解决方法:
诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。
3)富含GC的模板
建议解决方法:
对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
4)模板浓度太低
建议解决方法:
使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
5)镁离子浓度太低
建议解决方法:
从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6=退火温度太高
建议解决方法:
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序