质粒DNA的提取及定性定量分析

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实验目的

从上个实验中转化成功的军中提取出已经到克隆 的质粒，为下一步双酶切做好准备。

我们重点是要保证治理的序列、产率和纯度，去除Dnase、机械、物理、化学因素的影响。

并且学习和掌握碱裂解法 提取质粒的基本原理和实验技术方法。

实验原理及过程

实验步骤

实验原理

1将含pETBlue－2的单菌落接入3mL LBAmp+液体培养基中，37℃振荡培养过夜。让菌苏醒，增加菌的数量。 2培养的菌液，6000rpm，离心2min。去上清收集沉淀。收集、浓缩菌体。 3100 uL溶液I充分重悬菌体。这一步仅仅是为了吹散细胞。 4200uL溶液II，反复颠倒混匀（切勿旋涡振荡！），冰上放置，裂解至菌液变清。

利用碱法破碎细胞和提取质粒 。

碱法破碎细胞是因为NaOH可以破坏细胞膜 糖苷键，SDS可以破坏膜、变性膜蛋白。

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，基因组 染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。

这一步之后，细胞破碎，液体中将不会有沉淀而澄清。 因为细胞破碎，核基因组也释放到液体中，如果强烈震荡，会使核基因组因机械剪切断裂为小片断，在以后的离心中，不能与质粒分开，从而污染质粒。所以，要轻摇。

 

5加入150uL溶液III，反复颠倒混匀，冰浴5分钟。高盐（K+）。 这就是DNA复性。基因组染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 612000rpm，离心10min。小心取出上清。这时上清中有质粒、还有杂质的蛋白、脂类、糖类、可溶的小分子。 7向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24:1)，剧烈振荡混匀，12000 rpm，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。异戊醇防止液体在振摇时起泡；酚可以变性蛋白质并使其沉降；氯仿可以提取脂类，液体分层。 这里得酚是tris饱和酚，这样的酚饱和了水，不会抽提水层中的水，以致将DNA一并抽到有机层。Tris还可以起到调节PH稍微偏碱的作用。 这时蛋白质沉淀于两层之间（密度的原因）。 标记离心方向，因为沉淀有时看不见，而我们吸取液体是要从沉淀的反方向。 8上清中加入等体积氯仿：异戊醇(24:1) ，剧烈振荡混匀，12000rpm，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。去除酚，因为酚会影响双酶切酶的活性。 9上清中加入2倍体积无水乙醇剧烈振荡混匀，室温放置15 min沉淀DNA。12000rpm，离心10 min，弃上清。脱水，因为液体中含有大量的盐（溶液III），使DNA和RNA沉淀下来。而液体中委要出去的小分子、剩余的糖和脂。 10沉淀用1mL75%乙醇洗两次(12000rpm，离心5 min)。 11沉淀充分干燥。用20uL RTE(TE中含有20ug/ml的RNase)，温和振荡几秒钟，－20 oC保存。 RNase可以去除RNA 12电泳检测纯化的质粒载体（1 % Agarose）。80V

2uL质粒DNA + 1uL 10xloading + 0.5uL SYBR + 2 uL无菌水

结果用凝胶成像仪分析照相

 

可以测OD值

核酸带负电，向正极泳动。