质粒DNA的提取及电泳分析

实验目的

1．掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理和方法。

2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA方法。

3．熟悉质粒DNA提取与真核细胞核DNA提取的异同点。

实验原理

在pH值为12.0～12.6的碱性环境中，在去垢剂SDS的作用下，细菌的细胞壁与细胞膜均破裂，释放出大量的染色体DNA、RNA及质粒DNA。此时，所有双链DNA解聚成单链，但质粒DNA仍保持环状。当pH值恢复到中性时，在高盐浓度下，大分子量的染色体DNA只是部分复性，相互交织成不溶性的网状结构，与细胞碎片、部分蛋白质和大分子量的RNA一起沉淀，并可通过离心除去。而环状的质粒DNA可以完全复性，溶解于上清中，从而达到初步分离的目的。

采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其他细菌成分去除，最后以低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

操作步骤

1．取1.5ml过夜培养的菌液，12000 rpm，离心30s，弃上清，尽可能倒干，收集菌体沉淀。

2．用100μl 溶液I（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）重悬菌体沉淀，Tip吹打至彻底悬浮。

3．加入150μl 溶液II（0.2mol/L NaOH, 1% SDS），轻轻颠倒混匀4~6次，使充分菌体充分裂解，室温放置5 min，直至溶液变得清亮。

4．加入150μl 溶液III（4mol/L 盐酸胍，0.5mol/L KAc pH4.2），立即温和颠倒混匀4~6次。室温放置5 min，12000 rpm离心10 min，小心吸取上清。

5．加入400μl 结合缓冲液（5mol/L 盐酸胍，20mmol/L Tris-HCl pH6.6, 37.5%乙醇）于离心吸附柱中，然后将步骤4中的上清加入吸附柱中（不要将沉淀移入吸附柱），混匀，套入收集管中，12000 rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。

6．加入750μl 漂洗液（20mmol/L NaCl, 2mmol/L Tris-HCl pH7.5, 80%乙醇）于离心吸附柱中，静置1min ，12000 rpm离心15 s，倒掉收集管中废液。

7．重复步骤6一次。

8．再次于12000 rpm空离心2 min，尽量除去漂洗缓冲液中的乙醇。

9．取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf管中，在硅基质膜中央部位加入50μl洗脱缓冲液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA pH8.0)，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

10．丢弃离心吸附柱，溶液中含有目的质粒DNA，置于4℃或－20℃保存。

注意事项

1． 所用器具必须严格清洗，最后要用双蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌，防止外源性核酸酶对DNA的降解以及其他杂质的污染。

2． 细菌培养容器最好用三角烧瓶，其容量至少应为培养液体积的四倍，从而保证氧气的供应。细菌培养不要超过16 h，否则细菌会崩解，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。

3． 溶液I在用前加入RNase A，并置于4℃保存。

4． 在碱裂解提质粒的方法中，关键之一是加入溶液III的时机，这决定了DNA变性与复性的时间。既要使溶液II 与染色体DNA充分作用使之变性，又要保证质粒DNA不会因作用时间过久而发生不可逆的变性。若质粒变性过度，将引起提取效率下降、内切酶切割困难等一系列问题。因此，加入溶液II切忌剧烈振荡，时间不应超过5 mins。

5． 加溶液溶液III离心后，倘若上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6． 本试剂盒优点：快速、方便；产量高、纯度好；毒性低：采用硅基质膜离心柱纯化质粒DNA，不需酚、氯仿抽提