质粒DNA的提取

[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温培养箱
2．恒温摇床
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
(二)材料
1．带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌
2．1.5mL 离心管
3．枪头、枪
(三)试剂
质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

试剂盒的参考配方:
Solution I
50mmo1／L 葡萄糖
5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris・HCl(pH8.0)
1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
Solution II
0.4mo1／L NaOH，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
Solution III
5mo1／L 醋酸钾 60 mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE缓冲液
10mmo1／L Tris・HCl
1mmo1／L EDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
将RNA酶溶于10mmo1／L Tris・HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

[实验步骤]
(一)提取质粒
将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)
(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。

附：试剂盒说明书

3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1

试剂盒组成：

组成	K1910（50次）	K1920（100次）	K1930（250次）
Solution I(a)	5m 1	10m 1	25m 1
Solution II(b)	10m 1	20m 1	50ml
Solution lll	20m 1	50m 1	2x50m 1
Wash Solution (c)	22m 1	2x22m 1	5x22m 1
TE(d)	5m 1	10m 1	40m 1
3S Column	50支	100支	250支
Co11ection tube	50支	100支	250根
说明书	1份	1份	l份

注：
a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低―些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点：
● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)

1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。
2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；
质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5―10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。无需低温离心。
注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同―支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。