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质粒DNA 的提取

丁香园

3981

[ 实验目的 ]
 
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒
 
[ 实验原理 ]
 
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12. 0-12. 5 这个狭窄的范围内,线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入 Ph4. 8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时,共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕成网状结构,通过离心,染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA 、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
[ 仪器、材料与试剂 ]
 
(一)仪器
 
 
1. 恒温培养箱
 
2. 恒温摇床
 
3. 台式离心机
 
4. 高压灭菌锅
 
 
(二)材料
 
 
1. 葡萄糖
 
2. 三羟甲基氨基甲烷( Tris )
 
3. 乙二胺四乙酸( EDTA )
 
4. 氢氧化钠
 
5. 十二烷基硫酸钠
 
6. 乙酸钾
 
7. 冰乙酸
 
8. 氯仿
 
9. 乙醇
 
10. 胰 RNA 酶
 
11. 氨苄青霉素
 
12. 溴酚兰
 
14. Tris 饱和酚
 
15. 盐酸
 
16. 含 GST 质粒的大肠杆菌
 
17. 吸头、小离心管
 
 
( 三 ) 试剂
 
溶液 I :葡萄糖 50 mmol/L
 
Tris ( pH8. 0 ) 25 mmol/L
 
EDTA ( pH8. 0 ) 10 mmol/L
 
115℃ 灭菌, 4℃ 保存。
 
溶液 II : 氢氧化钠 0. 2 mol/L
 
SDS 1%
 
现用现配。先加水、再加 NaOH ,最后加 SDS ,顺序不可颠倒。
 
溶液 III : 5 mol/L 醋酸钾 60 ml
 
冰醋酸 11. 5 ml
 
去离子水 28. 5 ml
 
4℃ 保存。
 
[ 实验步骤 ]
 
1. 加含质粒的菌悬液 20ul 于 20mL 含氨苄青霉素( 100μg/mL )的 LB 培养基中培养, 37℃ 培养过夜。
 
2. 取 1. 0 mL 细菌培养物,加入 1. 5ml 离心管中, 8,000 r/min 离心 1 min 。
 
3. 除净上清,加 100μL 溶液 I ,用涡旋仪振荡混匀。
 
4. 加 200 μL 溶液 II (现用现配),盖紧管盖,迅速颠倒混匀,作用时间不要超过 5min 。
 
5. 加 150 μL 冰冷的溶液 III (冰上预冷),盖紧管盖,颠倒混匀,冰浴 10 min 。 6. 12,000 r/min 离心 10 min ,将上清转移到一个新的干净离心管中。
 
7. 向上清中加 0. 6 倍体积的异丙醇,混匀,室温作用 15 min , 12,000 r/min 离心 10 min 。
 
8. 弃上清,用 200ul70 % 乙醇洗沉淀一次,倒扣在纸巾上凉干。
 
9. 用 50ul100 μg/ml RNA 酶的 TE 溶解沉淀, 65℃ 作用 30 min 后,补加 400ulTE 。
 
10. 加等体积酚 - 氯仿,反复颠倒混合,进行抽提 , 12,000 r/min 离心 10 min 。
 
11. 重复 10 至两相界面无蛋白出现,再用氯仿抽提一次。
 
12. 取水相,加 2 倍体积无水乙醇及十分之一倍体积的 3 mol/L NaAc(pH5. 2) ,混匀, 12,000 r/min 离心 10 min ;弃上清,用预冷的 70 % 乙醇洗沉淀一次,倒扣在纸巾上凉干,用 30ulTE 溶解沉淀, -20℃ 存放备用。
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