质粒DNA 的提取

[ 实验目的 ]
 
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒
 
[ 实验原理 ]
 
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12. 0-12. 5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 Ph4. 8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA 、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
[ 仪器、材料与试剂 ]
 
（一）仪器
 
 
1. 恒温培养箱
 
2. 恒温摇床
 
3. 台式离心机
 
4. 高压灭菌锅
 
 
（二）材料
 
 
1. 葡萄糖
 
2. 三羟甲基氨基甲烷（ Tris ）
 
3. 乙二胺四乙酸（ EDTA ）
 
4. 氢氧化钠
 
5. 十二烷基硫酸钠
 
6. 乙酸钾
 
7. 冰乙酸
 
8. 氯仿
 
9. 乙醇
 
10. 胰 RNA 酶
 
11. 氨苄青霉素
 
12. 溴酚兰
 
14. Tris 饱和酚
 
15. 盐酸
 
16. 含 GST 质粒的大肠杆菌
 
17. 吸头、小离心管
 
 
( 三 ) 试剂
 
溶液 I ：葡萄糖 50 mmol/L
 
Tris （ pH8. 0 ） 25 mmol/L
 
EDTA （ pH8. 0 ） 10 mmol/L
 
115℃ 灭菌， 4℃ 保存。
 
溶液 II ： 氢氧化钠 0. 2 mol/L
 
SDS 1%
 
现用现配。先加水、再加 NaOH ，最后加 SDS ，顺序不可颠倒。
 
溶液 III ： 5 mol/L 醋酸钾 60 ml
 
冰醋酸 11. 5 ml
 
去离子水 28. 5 ml
 
4℃ 保存。
 
[ 实验步骤 ]
 
1. 加含质粒的菌悬液 20ul 于 20mL 含氨苄青霉素（ 100μg/mL ）的 LB 培养基中培养， 37℃ 培养过夜。
 
2. 取 1. 0 mL 细菌培养物，加入 1. 5ml 离心管中， 8,000 r/min 离心 1 min 。
 
3. 除净上清，加 100μL 溶液 I ，用涡旋仪振荡混匀。
 
4. 加 200 μL 溶液 II （现用现配），盖紧管盖，迅速颠倒混匀，作用时间不要超过 5min 。
 
5. 加 150 μL 冰冷的溶液 III （冰上预冷），盖紧管盖，颠倒混匀，冰浴 10 min 。 6. 12,000 r/min 离心 10 min ，将上清转移到一个新的干净离心管中。
 
7. 向上清中加 0. 6 倍体积的异丙醇，混匀，室温作用 15 min ， 12,000 r/min 离心 10 min 。
 
8. 弃上清，用 200ul70 % 乙醇洗沉淀一次，倒扣在纸巾上凉干。
 
9. 用 50ul100 μg/ml RNA 酶的 TE 溶解沉淀， 65℃ 作用 30 min 后，补加 400ulTE 。
 
10. 加等体积酚 - 氯仿，反复颠倒混合，进行抽提 , 12,000 r/min 离心 10 min 。
 
11. 重复 10 至两相界面无蛋白出现，再用氯仿抽提一次。
 
12. 取水相，加 2 倍体积无水乙醇及十分之一倍体积的 3 mol/L NaAc(pH5. 2) ，混匀， 12,000 r/min 离心 10 min ；弃上清，用预冷的 70 % 乙醇洗沉淀一次，倒扣在纸巾上凉干，用 30ulTE 溶解沉淀， -20℃ 存放备用。