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实时荧光定量PCR(real

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多聚集链反应(polymerase chain reaction,PCR )技术发明至今已近20年了,在这期间技术得到了不断的发展,近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工 具,本文就此技术及其应用做一综述。

1 实时荧光定量PCR 技术的方法学

1.1 原理 所谓real-time Q-PCR 技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期,Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭 的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。

PCR 反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 (baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义 样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。

1.2 荧光化学 目前real-time Q-PCR 所使用的荧光化学方法主要有五种,分别是:DNA结合染色,水解探针,分子信标,荧光标记引物,杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。

扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子,如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法,在PCR反应体系中,加入过量SYBR green 1荧光染料,SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增,不需要探针的设计,使检测方法变得简便,同时 也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合,因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合,使实验容易产生假阳性信号。引 物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线(melting curve)分析的软件加以解决。

扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物,它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策 略。目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分 别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团,此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移,FRET),因 此探针完整时,检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中,溶液中的模板变性后低温退火时,引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下, 沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基 团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现 了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

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