小牛胸腺DNA的制备
互联网
1998
- 相关专题
1. 了解DNA的存在状态，增加感性认识。
2. 掌握DNA的制备方法以及细胞分级，细胞核 制备，细胞膜裂解和解离DNA-蛋白复合体（DNP）的技术。
3. 学习用紫外分光光度计 测定DNA含量的方法。
二、实验原理
核酸是重要的生物大分子。在细胞核 内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。因此，在提取和制备DNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。
在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。
提取出DNA-蛋白质复合体（DNP）后，还必须将其中的蛋白质除去，因此，提取纯化DNA要经过以下四个步骤：
1. 制备细胞核 ；
2. 裂解细胞核 ；
3. 解离DNA—蛋白质复合体；
4. 从可溶性物质中分离出DNA。
小牛胸腺、猪脾、鱼精子和植物种子的胚胎等生物材料，细胞核含量比例大，因而含有丰富的DNA，是提取DNA的好材料。本实验以小牛胸腺或猪脾为材料。小牛胸腺不仅DNA含最高，而且其脱氧核糖核酸酶（DNase）的活性较低，在制备过程中由此酶所引起的DNA降解损失也较小。为了防止DNase的作用，在用于提取的缓冲液中均含有1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持 DNase活性所必须的Mg++离子。为防止DNA的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。
本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。
提取纯化后的小牛胸腺DNA用紫外分光光度法进行鉴定分析，并计算其收率和纯度。
本实验所得的DNA样品将用于实验五的Tm测定。
三、器材与试剂
器材：
1. 高速冷冻离心机，50ml塑料离心管，300ml塑料离心管
2.食品加工机和高速分散器
3. 恒温水浴
4. 磁力搅拌器
5. 量筒：50ml、250ml、500ml
6. 烧杯：100ml、500ml、1000ml
7. 具塞三角瓶：250ml
8. 小培养皿
9. 吹风机
10. 可扫描的紫外分光光度计
试剂：
a.0.01M柠檬酸钠－9mg/ml Nacl－1mmol/L EDTA ，pH 7.0，300ml
b.0.15M柠檬酸纳－1mmol/L EDTA，pH 7.0 ，300ml
c.20% SDS （公用）
d.氯仿－异戊醇（24 : 1）混合液 500ml
e.95% 乙醇和无水乙醇
f.丙酮
g.0.1mol/L NaOH
四、实验步骤
1.制备细胞核
⑴ 取小牛胸腺（或猪脾）在冰块上去除脂肪和结缔组织，切碎，称10g，放入食品加工机，加入予冷的试剂a.溶液60ml，打碎三次，每次20秒，仃20秒。将打碎后溶液倒入小烧杯，用高速分散器匀浆三次，每次20秒，仃20秒。
⑵ 将匀浆后溶液分装于两个50ml离心管，仔细平衡后，用高速冷冻离心机，4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清（脂肪层等）留沉淀。
⑶ 将沉淀置于小烧杯，加50ml予冷a液，用高速分散器同样再匀浆分散三次，同样4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清留沉淀。
⑷ 取出沉淀加60ml予冷b液，再高速分散二至三次，每次分散10秒，仃10秒。
2. 裂解细胞核
将悬浮液移入250ml烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入8ml 20% SDS，应观察到溶液明显变粘稠（报告中回答：为什么？）。用55℃水浴温热10min～15min，然后在搅拌下缓慢加入8～10g NaCl，再搅拌10min，使NaCl全溶，此时应观察到溶液变稀（为什么？）。冷却至室温。
3. 解离DNA—蛋白质复合体
⑴ 将溶液倒入250ml具塞三角瓶中，加入此溶液二分之一体积的d液（氯仿用于变性蛋白质，异戊醇用于消除泡沫，也可用异丙醇、异丁醇），剧烈振荡10min，倒入300ml离心管中，4℃，10000r/min，离心5～10min，用滴管取出上层水相，中层蛋白质界面弃去，下层有机相倒入回收并。
⑵取出的上层水相重复加d液、振荡、离心，至中层界面无混浊为止。
4. 提取DNA
⑴ 将取出的水相滴入予冷的95%乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状DNA沉淀。搅拌速度对产率有影响，若产出减少可补加或换新乙醇。（观察并解释实验现象）（回收乙醇）。
⑵ 搅起的DNA 置于已称重的小培养皿内，依次用95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状DNA沉淀至无浑浊为止，最后再用丙酮清洗一次，用吹风机将DNA吹干。
⑶ 称重，并计算产率。
5. 测定DNA
⑴ 准确称取50～100mg DNA，加少量0.1mol/L NaOH溶解，加H2O定容至50ml。
⑵ 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA的紫外吸收曲线，测定A260和A280，并计算比值：A260/A280，纯DNA的此比值约为1.8。
⑶ 根据：每毫升1微克的纯DNA的A260值= 0.020，计算所得DNA的纯度，并讨论纯度较低的原因和解决办法。
