材料与仪器
ATP [y-32P]ATP T4多核苷酸激酶 乙酸铵 乙醇 酚 氯仿 氯仿 异戊醇 NaOAc T4 DNA连接酶 酚 异丙醇 重蒸水 Sepharose CL-2B 溴化氰 N N-二甲基甲酰胺 NaOH 磷酸钾 KCl CNBr-活化的Sepharosundefined.4B HCl T4 多核苷酸激酶缓冲液 TE 接头-激酶缓冲液 乙醇胺-HCl 层析柱的储存缓冲液
SpeedVec 旋转浓缩器
SpeedVec 旋转浓缩器
步骤
材料与设备
ATP(20 mmol/L;pH7.0)
[y-32P]ATP(5uCi)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸铵 (10mol/L)
乙醇（100% 及 75%;v/v)
酚/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
NaOAc(3mol/L)
T4 DNA 连接酶（Stratagene)
酚（经 TE 平衡）
异丙醇（2-丙醇）
重蒸水
Sepharose CL-2B(pharmacia Biotech,Inc.)
溴化氰（CNBr)(Aldrich Chemical Co.,C9149-2)
N，N-二甲基甲酰胺
NaOH(5mol/L)
磷酸钾（lOmmol/L 及 lmol/Lt 均为 pH8.0)
KCl(1mol/L)
CNBr-活化的 Sepharosundefined.4B(Pharmacia Biotech,Inc.)
HCl(1 mmol/L)
SpeedVec 旋转浓缩器（Savant Instruments,Inc.)
试剂
T4 多核苷酸激酶缓冲液（10X)
TE
接头-激酶缓冲液（10x)
乙醇胺-HCl (1mol/L;pH8.0)〔用 HC1 将 1mol/L 乙醇胺 (游离碱) 调至 pH8.0〕
层析柱的储存缓冲液
(配方，见"试剂的配制"，P.131—138)
操作程序
寡核苷酸的 5'-磷酸化
1）配成下列反应混合物：
DNA(溶于 TE 的每份寡核苷酸为 440ug；即总 DNA880ug）65ul
T4 聚核苷酸激酶缓冲液（10X)10ul
总体积：75ul
2) 互补 DNA 双链变性后再退火：88°C 孵育 2 min，65°C 孵育 10 min,37°C 孵育 10 min，最后室温解育 5 min。
3) 合并下列溶液：
DNA(由上步得到）75ul
ATP(20 mml/L;pH7.0；含约 5uCi[γ-32P]ATP)15ul
T4 多核苷酸激酶 (100U)10ul
总体积：100ul
4)37°C 孵育 2 h, 加 50ul 10mol/L 乙酸铵及 100ul H20, 使终体积达 250ul。
5)65°C 加热 15 min, 使激酶失活。
6) 混合物降至室温。加 750ul 100% 乙醇，颠倒混勻。用微型离心机于室温下髙速离心 15 min, 沉淀 DNA。
7) 弃上清，加 225ulTE, 震荡，溶解沉淀 c
8) 加 250u1 1:1 的酚/氯仿，震荡混合 1 min, 高速离心 5 min, 使两相分离。
9) 将上层液体转移至一新管，加 250ul 24:1 氯仿/异戊醇，震荡混合 1min, 高速离心 5 min, 使两相分离。
10) 将上层转移至一新管中，加 25ul 3mol/LNaOAc，震荡混合。
11) 加 750ul 100% 乙醇，颠倒混匀，高速离心 15 min, 沉淀 DNA。
12) 弃上清，加 800ul 75% 乙醇，震荡混合，高速离心 5 min。
13) 弃上清，SpeedVac 旋转浓缩器干燥。
寡核苷酸的连接
1) 取 10ul 10X 接头-激酶缓冲液加入 65ul 水中，将 DNA 震荡溶解于此溶液。
2) 加 20ul 20 mmol/L ATP(pH7.0) 及 5ulT4 DNA 连接酶（30Weiss 单位)，得最终反应体积为 100ul。
3) 在室温下孵育≥2 h。若 AP-1 寡核苷酸的连接反应不进行，可试着将温度升至 30℃。
注：根据所用寒核苷酸的不同，连接反应的最适温度可在 4℃ 至 30℃ 之间变化。短的寡核苷酸（≤十五聚体）在较低温度下（4~15℃) 连接较好，而具有中等程度回文结构的寡核苷酸有自身退火的倾向，最好在较髙的温度下（15—30℃) 进行连接。
4）用琼脂糖凝胶电泳监视连接反应的进程 (每道用 0.5ul 连接反应物，连接好的寡核苷酸平均长度一般至少为十一聚体。
注：①5'-磷酸化的寡核苷酸开始时常常不能连接。因此，如果连接反应不发生，DNA 可用 1:1 酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次，然后用乙醇沉淀（用 NaOAc 作为盐)。将 DNA 溶于 225ul TE, 加 25ul 3mol/L NaOAc, 用 750ul 100% 乙辞重新沉淀 n 沉淀物用 75% 乙醇洗涤后，在 SpeedVac 浓缩器中干燥，然后再试着进行连接。②如可能，应将寡核苷酸连接达至少十聚体的长度。然而，如果不能实现有效的连接，用那些连接不好的 DNA 片段来制备 DNA 亲和介质也是可行的，因为在许多情况下已发现用单聚的互补寡核苷酸仍能有效地进行亲和层析。
偶联 Sepharose 用 DNA 的制备
用乙酸铵-异丙醇沉淀去除残留的 ATP, 否则会干扰连接好的 DNA 与 CNBr 活化 Sepharose 的偶联。
1) 于 100-ul 连接反应物中加入 100ul 酚（已经 TE 平衡，震荡混合 1 min。室温下，微型离心机离心 5 min, 将上层转移至新管。
2) 加 100ul 24:1 酚/异戊醇，震荡混合 1 min; 室温下，微型离心机高速离心 5 min; 将上层转移至新管。
3) 加 33ul 10mol/L 乙酸铵，震荡混合。
4) 加 133ul 异丙醇（2-丙醇)，颠倒混匀；-20℃, 孵育 20 min。高速离心 15 min, 沉淀 DNA。弃上清。
5) 加 225ul TE。震荡溶解沉淀，加 25ul 3mol/LNaOAc，震荡混合；加 750ul100% 乙醇，颠倒混匀；高速离心 15 min，沉淀 DNA; 弃上清。
6) 所得 DNA 用 75% 乙醇洗涤二次，SpeedVac 浓缩器干燥沉淀。
7) 将 DNA 溶于 50 ml 重蒸水中，-20℃ 保存。不要将 DNA 溶于 TE,TE 中的 Tris 缓冲液会干扰偶联反应。
用溴化氰将 DNA 偶联于 Sepharose
本项操作包括用溴化氰（CNBr) 活化 Sepharose CL-2B, 然后将连接好的 DNA 偶联到 CNBr 活化的 Sepharose 上。因 CNBr 有剧毒，故许多研究者喜欢选用下节所述的替代方法，即采用市售的已经 CNBr 活化的 Sepharose, 这样就不涉及 CNBr 的直接操作。用 CNBr 活化提供了选择介质的灵活性。我们一般选择 Sepharose CL-2B，这种介质是 Sepharose 2B 的交联形式，强度较高。但市售的经 CNBr 活化的介质只有 Sepharose4B。直接使用 CNBr 的另一个优点是制备活化介质所需的成本要低于购买预先活化好的介质。最后，尽管在纯化特定序列 DNA 结合蛋白时，两种方法制备的 DNA 亲和介质可能具有同样的效果，但本节所述的操作方法比下节所给出的方法用得更广泛些。
1) 于 60-ml 粗烧结玻板漏斗中，用重蒸水充分洗涤 10~15 ml(沉积后的床体 SepharoseCL-2B。洗胶约用 500 ml 水。
2) 将湿的 Sepharose 胶转移至带刻度的 25-ml 量筒，量取约 10-m 丨体积的沉积的胶，加水至终体积为 20 mL。将此浆状的胶转移至一置于水浴中（平衡至 15℃) 的 150-ml 玻璃烧中，水浴锅置于通风橱内的磁力揽拌器上。
3) 在通风橱内，称取 1.lgCNBr 置于一 25-ml 锥形瓶中，用石蜡膜封口。最好是 CNBr 量略多于而不是略少于 1.1 g。将 CNBr 溶于 2 ml N,N-二甲基甲酰胺。CNBr 会立即溶解。边搅拌边将 CNBr 溶液干 1 分钟内逐滴加至浆状 Sepharose 胶中。
4) 立即按如下所述加入 NaOH。在搅拌下，每 10s 加 30ul 5mol/LNaOH 于上述混合物中（在 15 亡下)，凡 10 min, 至所加 NaOH 总体积为 1.8 ml。
5) 立即加入 100 ml 冰冷的水于烧杯中，将混合物倾至一 60-ml 粗烧结玻板漏斗中。此时，极为重要的是不要将胶吸滤成干饼状。万一不慎在吸滤时将胶滤成干饼状，就不要再用这种干的胶，应从步骤 1）重新开始。
6) 用 100 ml 冰冷的水（≤4℃）洗胶 4 次，再用 100 ml 冰冷的 10mol/L 磷酸钾 (PH8.0) 洗涤 2 次。
7）立即将一半胶（5 ml) 转移到一具螺帽的 15-ml 聚丙烯管中，加入约 2 ml 10 mmol/L 磷酸钾 (pH8.0), 至胶成粘稠的浆状。
8) 立即加入 DNA(溶于 50ul 水中，总量为 880ug)。室温下在转盘上孵育过夜。
9) 将胶转移至一 60-ml 粗烧结玻板漏斗中，用 100 ml 水洗涤 2 次，再用 100 ml lmol/L 乙醇胺-HC1(PH8.0) 洗涤 1 次。
注；比较最初几毫升滤液与洗后介质中的放射性水平，估计 DNA 与介质结合的效率。通常. 所有可检测的放射性只存在于介质。
10) 将胶转移至一具螺帽的 5-ml 聚丙烯管中，加 1mol/L 乙醇胺-HCl(pH8.O)，至混合物呈平滑的浆状。室温下，在转盘上蜉育 4~6k 此步的目的是使未反应的 CNBr 活化 Sepharose 失活。
11) 用以下溶液洗胶：
10 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH8.0)100 ml
1mol/L 磷钾缓冲液 (pH8.0)100 ml
1mol/LKCl 100 ml
H20 100 ml
柱保存缓冲液 100 ml
12) 制备好的胶于 4℃ 下保存（不要冷冻)。该胶在下至少可稳定 1 年。
用 CNBr 活化的 Sepharose 将 DNA 偶联于 Sepharose 本操作用市售的经 CNBr 活化的 Sepharose 开始，比上节所述的方法更安全、简便，上节所述方法涉及 CNBr 活化介质的制备。
1) 称取 2 g 已经 CNBr 活化的 Sepharose4B 胶。
注：1 g 冻千材料可得终体积约 3.5 ml。
2) 于烧结玻板漏斗中，用 400 ml lmml/LHC1 洗涤并溶胀凝胶约 15 min。
3) 胶先用 100 mlH2O 洗涤，再用 100 ml 10 mmol/L 磷酸钾 (pH8.0) 洗涤。
4) 立即将 5 ml 胶转移至一具缧帽的 15-ml 聚丙烯管中，加入约 2 ml 10 mmol/L 磷酸钾 (pH8.0)，至成粘稠的浆状。
5) 立即加入 DNA(溶于 50ul H2O 中，总量为 880ul)。室温下，在转盘上孵育 5~6 h(如需要，孵育过夜)。
6) 将胶转移至一 60-ml 粗烧结玻板漏斗中，用 100 mlH20 洗涤 2 次，再用 100 ml 1mol/L 乙醇胺-HC1(pH8.0) 洗涤 1 次。
注：比较最初几毫升滤液与洗后介质中的放射性水平，估计 DNA 与介质结合的效率。通常，所有可检出的放射性只存在于介质 a
7）将胶转移到一具螺帽的 15-ml 聚丙烯管中，加 lmol/L 乙醇胺-HCl(pH8.0), 至混合物呈平滑的浆状。室温下，在转盘上孵育 4~6 h。此步的目的是使未反应的 CNBr 活 Sepharose 失活。
8) 用以下溶液洗胶：
10 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH8.0) 100 ml
1mol/L 磷酸钾缓冲液 (pH8.0) 100 ml
1mol/LKCl 100 ml
H20 100 ml
柱保存缓冲液 100 ml
9) 制备好的胶于 4℃ 下保存（不要冷冻)。该胶在下至少可稳定 1 年。
ATP(20 mmol/L;pH7.0)
[y-32P]ATP(5uCi)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸铵 (10mol/L)
乙醇（100% 及 75%;v/v)
酚/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
NaOAc(3mol/L)
T4 DNA 连接酶（Stratagene)
酚（经 TE 平衡）
异丙醇（2-丙醇）
重蒸水
Sepharose CL-2B(pharmacia Biotech,Inc.)
溴化氰（CNBr)(Aldrich Chemical Co.,C9149-2)
N，N-二甲基甲酰胺
NaOH(5mol/L)
磷酸钾（lOmmol/L 及 lmol/Lt 均为 pH8.0)
KCl(1mol/L)
CNBr-活化的 Sepharosundefined.4B(Pharmacia Biotech,Inc.)
HCl(1 mmol/L)
SpeedVec 旋转浓缩器（Savant Instruments,Inc.)
试剂
T4 多核苷酸激酶缓冲液（10X)
TE
接头-激酶缓冲液（10x)
乙醇胺-HCl (1mol/L;pH8.0)〔用 HC1 将 1mol/L 乙醇胺 (游离碱) 调至 pH8.0〕
层析柱的储存缓冲液
(配方，见"试剂的配制"，P.131—138)
操作程序
寡核苷酸的 5'-磷酸化
1）配成下列反应混合物：
DNA(溶于 TE 的每份寡核苷酸为 440ug；即总 DNA880ug）65ul
T4 聚核苷酸激酶缓冲液（10X)10ul
总体积：75ul
2) 互补 DNA 双链变性后再退火：88°C 孵育 2 min，65°C 孵育 10 min,37°C 孵育 10 min，最后室温解育 5 min。
3) 合并下列溶液：
DNA(由上步得到）75ul
ATP(20 mml/L;pH7.0；含约 5uCi[γ-32P]ATP)15ul
T4 多核苷酸激酶 (100U)10ul
总体积：100ul
4)37°C 孵育 2 h, 加 50ul 10mol/L 乙酸铵及 100ul H20, 使终体积达 250ul。
5)65°C 加热 15 min, 使激酶失活。
6) 混合物降至室温。加 750ul 100% 乙醇，颠倒混勻。用微型离心机于室温下髙速离心 15 min, 沉淀 DNA。
7) 弃上清，加 225ulTE, 震荡，溶解沉淀 c
8) 加 250u1 1:1 的酚/氯仿，震荡混合 1 min, 高速离心 5 min, 使两相分离。
9) 将上层液体转移至一新管，加 250ul 24:1 氯仿/异戊醇，震荡混合 1min, 高速离心 5 min, 使两相分离。
10) 将上层转移至一新管中，加 25ul 3mol/LNaOAc，震荡混合。
11) 加 750ul 100% 乙醇，颠倒混匀，高速离心 15 min, 沉淀 DNA。
12) 弃上清，加 800ul 75% 乙醇，震荡混合，高速离心 5 min。
13) 弃上清，SpeedVac 旋转浓缩器干燥。
寡核苷酸的连接
1) 取 10ul 10X 接头-激酶缓冲液加入 65ul 水中，将 DNA 震荡溶解于此溶液。
2) 加 20ul 20 mmol/L ATP(pH7.0) 及 5ulT4 DNA 连接酶（30Weiss 单位)，得最终反应体积为 100ul。
3) 在室温下孵育≥2 h。若 AP-1 寡核苷酸的连接反应不进行，可试着将温度升至 30℃。
注：根据所用寒核苷酸的不同，连接反应的最适温度可在 4℃ 至 30℃ 之间变化。短的寡核苷酸（≤十五聚体）在较低温度下（4~15℃) 连接较好，而具有中等程度回文结构的寡核苷酸有自身退火的倾向，最好在较髙的温度下（15—30℃) 进行连接。
4）用琼脂糖凝胶电泳监视连接反应的进程 (每道用 0.5ul 连接反应物，连接好的寡核苷酸平均长度一般至少为十一聚体。
注：①5'-磷酸化的寡核苷酸开始时常常不能连接。因此，如果连接反应不发生，DNA 可用 1:1 酚/氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次，然后用乙醇沉淀（用 NaOAc 作为盐)。将 DNA 溶于 225ul TE, 加 25ul 3mol/L NaOAc, 用 750ul 100% 乙辞重新沉淀 n 沉淀物用 75% 乙醇洗涤后，在 SpeedVac 浓缩器中干燥，然后再试着进行连接。②如可能，应将寡核苷酸连接达至少十聚体的长度。然而，如果不能实现有效的连接，用那些连接不好的 DNA 片段来制备 DNA 亲和介质也是可行的，因为在许多情况下已发现用单聚的互补寡核苷酸仍能有效地进行亲和层析。
偶联 Sepharose 用 DNA 的制备
用乙酸铵-异丙醇沉淀去除残留的 ATP, 否则会干扰连接好的 DNA 与 CNBr 活化 Sepharose 的偶联。
1) 于 100-ul 连接反应物中加入 100ul 酚（已经 TE 平衡，震荡混合 1 min。室温下，微型离心机离心 5 min, 将上层转移至新管。
2) 加 100ul 24:1 酚/异戊醇，震荡混合 1 min; 室温下，微型离心机高速离心 5 min; 将上层转移至新管。
3) 加 33ul 10mol/L 乙酸铵，震荡混合。
4) 加 133ul 异丙醇（2-丙醇)，颠倒混匀；-20℃, 孵育 20 min。高速离心 15 min, 沉淀 DNA。弃上清。
5) 加 225ul TE。震荡溶解沉淀，加 25ul 3mol/LNaOAc，震荡混合；加 750ul100% 乙醇，颠倒混匀；高速离心 15 min，沉淀 DNA; 弃上清。
6) 所得 DNA 用 75% 乙醇洗涤二次，SpeedVac 浓缩器干燥沉淀。
7) 将 DNA 溶于 50 ml 重蒸水中，-20℃ 保存。不要将 DNA 溶于 TE,TE 中的 Tris 缓冲液会干扰偶联反应。
用溴化氰将 DNA 偶联于 Sepharose
本项操作包括用溴化氰（CNBr) 活化 Sepharose CL-2B, 然后将连接好的 DNA 偶联到 CNBr 活化的 Sepharose 上。因 CNBr 有剧毒，故许多研究者喜欢选用下节所述的替代方法，即采用市售的已经 CNBr 活化的 Sepharose, 这样就不涉及 CNBr 的直接操作。用 CNBr 活化提供了选择介质的灵活性。我们一般选择 Sepharose CL-2B，这种介质是 Sepharose 2B 的交联形式，强度较高。但市售的经 CNBr 活化的介质只有 Sepharose4B。直接使用 CNBr 的另一个优点是制备活化介质所需的成本要低于购买预先活化好的介质。最后，尽管在纯化特定序列 DNA 结合蛋白时，两种方法制备的 DNA 亲和介质可能具有同样的效果，但本节所述的操作方法比下节所给出的方法用得更广泛些。
1) 于 60-ml 粗烧结玻板漏斗中，用重蒸水充分洗涤 10~15 ml(沉积后的床体 SepharoseCL-2B。洗胶约用 500 ml 水。
2) 将湿的 Sepharose 胶转移至带刻度的 25-ml 量筒，量取约 10-m 丨体积的沉积的胶，加水至终体积为 20 mL。将此浆状的胶转移至一置于水浴中（平衡至 15℃) 的 150-ml 玻璃烧中，水浴锅置于通风橱内的磁力揽拌器上。
3) 在通风橱内，称取 1.lgCNBr 置于一 25-ml 锥形瓶中，用石蜡膜封口。最好是 CNBr 量略多于而不是略少于 1.1 g。将 CNBr 溶于 2 ml N,N-二甲基甲酰胺。CNBr 会立即溶解。边搅拌边将 CNBr 溶液干 1 分钟内逐滴加至浆状 Sepharose 胶中。
4) 立即按如下所述加入 NaOH。在搅拌下，每 10s 加 30ul 5mol/LNaOH 于上述混合物中（在 15 亡下)，凡 10 min, 至所加 NaOH 总体积为 1.8 ml。
5) 立即加入 100 ml 冰冷的水于烧杯中，将混合物倾至一 60-ml 粗烧结玻板漏斗中。此时，极为重要的是不要将胶吸滤成干饼状。万一不慎在吸滤时将胶滤成干饼状，就不要再用这种干的胶，应从步骤 1）重新开始。
6) 用 100 ml 冰冷的水（≤4℃）洗胶 4 次，再用 100 ml 冰冷的 10mol/L 磷酸钾 (PH8.0) 洗涤 2 次。
7）立即将一半胶（5 ml) 转移到一具螺帽的 15-ml 聚丙烯管中，加入约 2 ml 10 mmol/L 磷酸钾 (pH8.0), 至胶成粘稠的浆状。
8) 立即加入 DNA(溶于 50ul 水中，总量为 880ug)。室温下在转盘上孵育过夜。
9) 将胶转移至一 60-ml 粗烧结玻板漏斗中，用 100 ml 水洗涤 2 次，再用 100 ml lmol/L 乙醇胺-HC1(PH8.0) 洗涤 1 次。
注；比较最初几毫升滤液与洗后介质中的放射性水平，估计 DNA 与介质结合的效率。通常. 所有可检测的放射性只存在于介质。
10) 将胶转移至一具螺帽的 5-ml 聚丙烯管中，加 1mol/L 乙醇胺-HCl(pH8.O)，至混合物呈平滑的浆状。室温下，在转盘上蜉育 4~6k 此步的目的是使未反应的 CNBr 活化 Sepharose 失活。
11) 用以下溶液洗胶：
10 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH8.0)100 ml
1mol/L 磷钾缓冲液 (pH8.0)100 ml
1mol/LKCl 100 ml
H20 100 ml
柱保存缓冲液 100 ml
12) 制备好的胶于 4℃ 下保存（不要冷冻)。该胶在下至少可稳定 1 年。
用 CNBr 活化的 Sepharose 将 DNA 偶联于 Sepharose 本操作用市售的经 CNBr 活化的 Sepharose 开始，比上节所述的方法更安全、简便，上节所述方法涉及 CNBr 活化介质的制备。
1) 称取 2 g 已经 CNBr 活化的 Sepharose4B 胶。
注：1 g 冻千材料可得终体积约 3.5 ml。
2) 于烧结玻板漏斗中，用 400 ml lmml/LHC1 洗涤并溶胀凝胶约 15 min。
3) 胶先用 100 mlH2O 洗涤，再用 100 ml 10 mmol/L 磷酸钾 (pH8.0) 洗涤。
4) 立即将 5 ml 胶转移至一具缧帽的 15-ml 聚丙烯管中，加入约 2 ml 10 mmol/L 磷酸钾 (pH8.0)，至成粘稠的浆状。
5) 立即加入 DNA(溶于 50ul H2O 中，总量为 880ul)。室温下，在转盘上孵育 5~6 h(如需要，孵育过夜)。
6) 将胶转移至一 60-ml 粗烧结玻板漏斗中，用 100 mlH20 洗涤 2 次，再用 100 ml 1mol/L 乙醇胺-HC1(pH8.0) 洗涤 1 次。
注：比较最初几毫升滤液与洗后介质中的放射性水平，估计 DNA 与介质结合的效率。通常，所有可检出的放射性只存在于介质 a
7）将胶转移到一具螺帽的 15-ml 聚丙烯管中，加 lmol/L 乙醇胺-HCl(pH8.0), 至混合物呈平滑的浆状。室温下，在转盘上孵育 4~6 h。此步的目的是使未反应的 CNBr 活 Sepharose 失活。
8) 用以下溶液洗胶：
10 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH8.0) 100 ml
1mol/L 磷酸钾缓冲液 (pH8.0) 100 ml
1mol/LKCl 100 ml
H20 100 ml
柱保存缓冲液 100 ml
9) 制备好的胶于 4℃ 下保存（不要冷冻)。该胶在下至少可稳定 1 年。
来源：丁香实验
