DNA的限制性酶切及电泳分析

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实验目的：
　　1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。
　　2．掌握重组 质粒DNA的酶切鉴定方法。
　　3．掌握琼脂 糖凝胶电泳分析酶切结果。
基本原理
　　限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。
主要试剂
　　重组 质粒DNA 插入片段300bp
　　本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：
　　5′----G↓AATT C----3′
　　3′----C TTAA↑G----5′
磷酸二脂键断裂 产生5′粘性末端。
操作步骤
1. 反应体系的建立：
⑴ 在一无菌1.5 ml eppendorf 管中加入：
　　无菌双蒸水 7 μl
　　10×酶切缓冲液 2 μl
　　质粒 DNA(100 ng/μl) 10 μl
　　EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl
　　总体积为20μl
　　⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。
　　2. 37 ℃水浴1 h。
　　3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。
　　4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。
　　5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。
　　6 结果观察。
操作注意事项：
　　1. 吸样量一定要准确
　　2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶
　　3. 要求在冰上操作，并充分混匀，
　　4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。
　　5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。
限制性内切酶酶解中常见的问题和原因
　　1． DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
　　2． DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。
　　3． DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。