DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法

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实验目的：

1.掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。

2.掌握重组 质粒 DNA的酶切鉴定方法。

3.掌握琼脂 糖凝胶电泳 分析酶切结果。

基本原理

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶(水解磷酸二酯键)。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。

主要试剂

重组质粒DNA 插入片段300bp

本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：

5′----G↓AATT C----3′

3′----C TTAA↑G----5′

磷酸二脂键断裂 产生5′粘性末端。

操作步骤

1. 反应体系的建立：

⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：

无菌双蒸水 7 μl

10×酶切缓冲液 2 μl

质粒DNA(100 ng/μl) 10 μl

EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl

总体积为20μl

⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。

3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。

4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。

5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。

6 结果观察。

操作注意事项：

1. 吸样量一定要准确

2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶

3. 要求在冰上操作，并充分混匀，

4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

限制性内切酶 酶解中常见的问题和原因

1. DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活;②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA 等;③非限制性内切酶最佳反应条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

2. DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反应条件不佳;③酶切位点被修饰;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。

3. DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力;②存在第二种限制性内切酶污染;③样品DNA中含有其它DNA。