DNA 酶 I 足迹分析实验
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材料与仪器
32P-标记 DNA 酶 I 足迹探针 酚 氯仿 乙醇 聚乙烯醇 竞争 DNA 缓冲液 Z'(或缓冲液 Ze） DNA 酶 I MgCl2(10 mmol L) CaCl2(5 mmol L) DNA 酶 I 终止液 蛋白酶 K 甲酰胺加样缓冲液
步骤
材料
32P-标记 DNA 酶 I 足迹探针
酚/氯仿（1:1;v/v)
乙醇（100% 和 75%;v/v)
试剂
聚乙烯醇（10%;w/v)
竞争 DNA
缓冲液 Z'(或缓冲液 Ze）
DNA 酶 I(2,5 mg/ml)
MgCl2(10 mmol/L)/CaCl2(5 mmol/L)
DNA 酶 I 终止液
蛋白酶 K(2.5 mg/ml)
甲酰胺加样缓冲液
(配方，见“试剂的配制”，PP.131~138)
操作程序
1)1.5-ml 塑料微量离心管置冰上预冷。加入 DNA 酶 I 终止液前可不必盖盖，（见步骤 11,P.124)
2) 按如下配方配制供所有反应用的组合探针 DNA 混合物：
1X 探针 DNA 混合物（用于一次反应)
32P-标记 DNA 探针 Xul
聚乙烯醇 (10%) 10ul
小牛胸腺 DNA(1 mg/ml);poly(dI-dC)、poly(dG-dC)、 0.2~1ul
或 poly(dA，dT)(10A260nm 单位；或不含竞争 DNA(用于
纯的或近似纯的蛋白质)。对 S-300 柱组分（10ul), 用
(0.2ul10A260nm 单位 poly(dI-dC)
H20 Zul
总体积 25ul
震荡，使探针 DNA 混合物彻底混匀。聚乙烯醇较粘稠，只有充分震荡才能使探针 DNA 溶液完全混合。
注：1. 聚乙烯醇可能会促进因子与 DNA 的结合。它大概是作为“分子拥挤剂（molecularcroudingagent)"而起作用的，分子拥挤剂 [”体积排阻剂（volumeexcluder)“] 可加大分子如蛋白质和 DNA 的有效浓度（可把它想象成分子海绵，它只吸水和小离子而不吸大分子 2. 竞争 DNA 可用可不用，但分析粗制的蛋白质组分时，用竞争 DNA 常常是有益的。
注意，加入竞争 DNA 的时间可能是一个重要参数。一般，竞争 DNA 与探针混合物一起加人，如本方案中 AP-1 的足迹分析。不过，在某些情况下，加入蛋白质组分和探针混合后再在毎个管中分别加入竞争 DNA, 可能会更好座。加入竞争 DNA 的最适时间应由实验定。
3) 于每个反应管中加入适量的缓冲液 Z'十 0.1mol/LKC1 和缓冲液 Z'+0.0mI/LKCl。
注：缓冲液 Z'+蛋白质组分混合物的终体积应为 25ul, 混合物中 KCl 的终浓度应为 0.1mol/L。例如，若用足迹法分析 5ul 含 0.3mol/L 的蛋白质组分，需加入 10ul 缓冲液 Z'+0.0 ml/LKCl 和 10ul 缓冲液 Z'+0.1mol/LKCl, 以使盐的终浓度为 0.1mol/LKC1。
4) 将蛋白质组分直毕加于装有适量适当类型 (0.0moI/LKCl 或 0.1mol/LKC1) 的缓冲液 Z'的 f 反应管中。
5) 每个反应管中加入 25ul 探针 DNA 混合物，轻弹混合样品，置冰上孵育 15 min。同时，取一份 2.5 mg/ml DNA 酶 I 储液解冻。
7) 探针 DNA 和蛋白质组分孵育 15 min，临结束前，用冰预冷的水稀释 DMA 酶Ⅰ。然后颠倒并温和震荡，使之彻底混匀。
注：对于不含蛋白质的阴性对照反应，2ul 1:2000 倍稀释的 DNA 酶 I 可用于大多数 DNA 探针。而对于持定的 DNA 序列，DNA 酶 I 的最适用量可因序列不同而异，对与不纯蛋白质的反应，由于可能存在 DNAIII 抑制剂如肌动蛋白单体，通常需要多加一点 DNA 酶 I。粗制的蛋白质组分需要比正常多 20~100 倍的 DNASI。部分纯化的蛋白质组分需要比正常多 3~10 倍的 DMA 酶 I。纯的蛋白质组分不需要任何过量的 DNA 酶 I。对每个待分析的蛋白质组分，均必须确定其最适的 DNA 酶 I 稀释度。
8）从冰上取下一份 DNA 探针和蛋白质组分样品，室温放置 1 min。
注；足迹分析时，所有必需的东西自动移液器、溶液、定时器、震荡器，DNA 酶Ⅰ）均井然有序地摆放在--起是有益的。本操作程序进行得越顺当，足迹分析的结果将会越好(且重复性也越好)。
9) 于反应管中加入 50ul 10 mmol/L MgCl2 5 mmol/L CaCl2 溶液（室温)，轻弹混合。于室温放置 1 min。
10) 于反应管中加入稀释的 DNA 酶 I 立刻轻弹混合。室温孵育 lmin。
注：粗制蛋白质组分中的内源性核酸酶会改变 DNA 酶 I 的消化梯。因此，在对粗提物进行足迹分析时，应包括只含提取物而不加 DNA 酶Ⅰ的对照反应。
11) 加 90ulDNA 酶 I 终止液。震荡混合。
注：通常，每个周期分析三个（或更多个）样品，下面的例子叙述了如何同时进行三个样品的分析。
12)(本步可任选）所有样品的足迹反应都完成后，加入 10ul2.5 mg/ml 蛋白酶 K, 温和震荡混合，室温放置 5 min。这一步对蛋白质的粗提物很有用，但对纯的蛋白质则不是必需的。（本步可任选）
13) 为制备电泳样品，可加 200ul1:1 酚/氯仿。震荡混合。离心 5 min。
14) 上层转移至一新管。加 800ul100% 乙醇。颠倒混合，离心 15 min, 沉淀核酸。
15) 移去上清。加 800ul75% 乙醇。震荡混合。离心 5 min。
16) 移去上清。用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀物。
17) 加 9ul 甲酰胺加样缓冲液，震荡溶解沉淀物。
18) 煮沸 3 min, 置冰上冷却。
19) 离心 0.5s, 使溶液沉至管底。震荡混合。加样 4ul 于序列分折胶上。
注：为确定蛋白结合位点的位置，可将 DNA 酶 I 的酶切样品加在邻接于 Maxam-Gilbert 测序梯（sequencingladder)(由足迹探针制备）的泳道上。
32P-标记 DNA 酶 I 足迹探针
酚/氯仿（1:1;v/v)
乙醇（100% 和 75%;v/v)
试剂
聚乙烯醇（10%;w/v)
竞争 DNA
缓冲液 Z'(或缓冲液 Ze）
DNA 酶 I(2,5 mg/ml)
MgCl2(10 mmol/L)/CaCl2(5 mmol/L)
DNA 酶 I 终止液
蛋白酶 K(2.5 mg/ml)
甲酰胺加样缓冲液
(配方，见“试剂的配制”，PP.131~138)
操作程序
1)1.5-ml 塑料微量离心管置冰上预冷。加入 DNA 酶 I 终止液前可不必盖盖，（见步骤 11,P.124)
2) 按如下配方配制供所有反应用的组合探针 DNA 混合物：
1X 探针 DNA 混合物（用于一次反应)
32P-标记 DNA 探针 Xul
聚乙烯醇 (10%) 10ul
小牛胸腺 DNA(1 mg/ml);poly(dI-dC)、poly(dG-dC)、 0.2~1ul
或 poly(dA，dT)(10A260nm 单位；或不含竞争 DNA(用于
纯的或近似纯的蛋白质)。对 S-300 柱组分（10ul), 用
(0.2ul10A260nm 单位 poly(dI-dC)
H20 Zul
总体积 25ul
震荡，使探针 DNA 混合物彻底混匀。聚乙烯醇较粘稠，只有充分震荡才能使探针 DNA 溶液完全混合。
注：1. 聚乙烯醇可能会促进因子与 DNA 的结合。它大概是作为“分子拥挤剂（molecularcroudingagent)"而起作用的，分子拥挤剂 [”体积排阻剂（volumeexcluder)“] 可加大分子如蛋白质和 DNA 的有效浓度（可把它想象成分子海绵，它只吸水和小离子而不吸大分子 2. 竞争 DNA 可用可不用，但分析粗制的蛋白质组分时，用竞争 DNA 常常是有益的。
注意，加入竞争 DNA 的时间可能是一个重要参数。一般，竞争 DNA 与探针混合物一起加人，如本方案中 AP-1 的足迹分析。不过，在某些情况下，加入蛋白质组分和探针混合后再在毎个管中分别加入竞争 DNA, 可能会更好座。加入竞争 DNA 的最适时间应由实验定。
3) 于每个反应管中加入适量的缓冲液 Z'十 0.1mol/LKC1 和缓冲液 Z'+0.0mI/LKCl。
注：缓冲液 Z'+蛋白质组分混合物的终体积应为 25ul, 混合物中 KCl 的终浓度应为 0.1mol/L。例如，若用足迹法分析 5ul 含 0.3mol/L 的蛋白质组分，需加入 10ul 缓冲液 Z'+0.0 ml/LKCl 和 10ul 缓冲液 Z'+0.1mol/LKCl, 以使盐的终浓度为 0.1mol/LKC1。
4) 将蛋白质组分直毕加于装有适量适当类型 (0.0moI/LKCl 或 0.1mol/LKC1) 的缓冲液 Z'的 f 反应管中。
5) 每个反应管中加入 25ul 探针 DNA 混合物，轻弹混合样品，置冰上孵育 15 min。同时，取一份 2.5 mg/ml DNA 酶 I 储液解冻。
7) 探针 DNA 和蛋白质组分孵育 15 min，临结束前，用冰预冷的水稀释 DMA 酶Ⅰ。然后颠倒并温和震荡，使之彻底混匀。
注：对于不含蛋白质的阴性对照反应，2ul 1:2000 倍稀释的 DNA 酶 I 可用于大多数 DNA 探针。而对于持定的 DNA 序列，DNA 酶 I 的最适用量可因序列不同而异，对与不纯蛋白质的反应，由于可能存在 DNAIII 抑制剂如肌动蛋白单体，通常需要多加一点 DNA 酶 I。粗制的蛋白质组分需要比正常多 20~100 倍的 DNASI。部分纯化的蛋白质组分需要比正常多 3~10 倍的 DMA 酶 I。纯的蛋白质组分不需要任何过量的 DNA 酶 I。对每个待分析的蛋白质组分，均必须确定其最适的 DNA 酶 I 稀释度。
8）从冰上取下一份 DNA 探针和蛋白质组分样品，室温放置 1 min。
注；足迹分析时，所有必需的东西自动移液器、溶液、定时器、震荡器，DNA 酶Ⅰ）均井然有序地摆放在--起是有益的。本操作程序进行得越顺当，足迹分析的结果将会越好(且重复性也越好)。
9) 于反应管中加入 50ul 10 mmol/L MgCl2 5 mmol/L CaCl2 溶液（室温)，轻弹混合。于室温放置 1 min。
10) 于反应管中加入稀释的 DNA 酶 I 立刻轻弹混合。室温孵育 lmin。
注：粗制蛋白质组分中的内源性核酸酶会改变 DNA 酶 I 的消化梯。因此，在对粗提物进行足迹分析时，应包括只含提取物而不加 DNA 酶Ⅰ的对照反应。
11) 加 90ulDNA 酶 I 终止液。震荡混合。
注：通常，每个周期分析三个（或更多个）样品，下面的例子叙述了如何同时进行三个样品的分析。
12)(本步可任选）所有样品的足迹反应都完成后，加入 10ul2.5 mg/ml 蛋白酶 K, 温和震荡混合，室温放置 5 min。这一步对蛋白质的粗提物很有用，但对纯的蛋白质则不是必需的。（本步可任选）
13) 为制备电泳样品，可加 200ul1:1 酚/氯仿。震荡混合。离心 5 min。
14) 上层转移至一新管。加 800ul100% 乙醇。颠倒混合，离心 15 min, 沉淀核酸。
15) 移去上清。加 800ul75% 乙醇。震荡混合。离心 5 min。
16) 移去上清。用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀物。
17) 加 9ul 甲酰胺加样缓冲液，震荡溶解沉淀物。
18) 煮沸 3 min, 置冰上冷却。
19) 离心 0.5s, 使溶液沉至管底。震荡混合。加样 4ul 于序列分折胶上。
注：为确定蛋白结合位点的位置，可将 DNA 酶 I 的酶切样品加在邻接于 Maxam-Gilbert 测序梯（sequencingladder)(由足迹探针制备）的泳道上。
来源：丁香实验
