材料与仪器
步骤
##一、材料
###1.封闭:偶发的损伤修复(repair of adventitious damage, RAD)
(1) 高分子质量基因组 D N A : 330 ug/mL 溶 于 T E 缓 冲 液(10 m m 〇l/L Tris, I
###2 限制性酶切和同位素标记
###3 二维电泳
3.1 一 向 电 泳(1st D)
制备凝胶和原位消化所需要的装置如图2所示。
3.2 原 位 限 制 性 内 切 酶 消 化
3.3 二 向 电 泳(2n d D )
###4 放射自显影
##二、方法
###1.偶发性损伤修复(「封闭」,「blocking」)
###2.限 制 性 酶 切 消 化 和 同 位 素 标 记
###3.双向电泳
在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究基 金 会(Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划(The BiochemicalGeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶电泳系统进行蛋白质突变体的研究,现在这种技术被用于 D N A 上。经过多次试验,我已经在内径 2. 4 m m 的 Telflon 管中进行琼脂糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发现由于管内壁不平整,可使得在长时间的电泳过程中,琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝胶 由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和 59 c m 0 •9 % 的分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。这种装置可以同时分析 10 个 D N A 样本。垂直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子 D N A片段。此系统大大地减小了电泳的空间,并降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶的 量(原来的系统每个反应需要使用 Hinf I
3.1 一向电泳
3.1.1 琼脂糖圆盘凝胶的制备
3.1.2 电泳
3.1.3 原位限制性内切酶消化
3.2 第二向电泳
3.2.1 制胶
3.2.2 电 泳
3.3 放射自显影
###4 图像分析
###5 RLGS 用到的其他内切酶
###1.封闭:偶发的损伤修复(repair of adventitious damage, RAD)
(1) 高分子质量基因组 D N A : 330 ug/mL 溶 于 T E 缓 冲 液(10 m m 〇l/L Tris, I
###2 限制性酶切和同位素标记
###3 二维电泳
3.1 一 向 电 泳(1st D)
制备凝胶和原位消化所需要的装置如图2所示。
3.2 原 位 限 制 性 内 切 酶 消 化
3.3 二 向 电 泳(2n d D )
###4 放射自显影
##二、方法
###1.偶发性损伤修复(「封闭」,「blocking」)
###2.限 制 性 酶 切 消 化 和 同 位 素 标 记
###3.双向电泳
在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究基 金 会(Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划(The BiochemicalGeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶电泳系统进行蛋白质突变体的研究,现在这种技术被用于 D N A 上。经过多次试验,我已经在内径 2. 4 m m 的 Telflon 管中进行琼脂糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发现由于管内壁不平整,可使得在长时间的电泳过程中,琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝胶 由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和 59 c m 0 •9 % 的分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。这种装置可以同时分析 10 个 D N A 样本。垂直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子 D N A片段。此系统大大地减小了电泳的空间,并降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶的 量(原来的系统每个反应需要使用 Hinf I
3.1 一向电泳
3.1.1 琼脂糖圆盘凝胶的制备
3.1.2 电泳
3.1.3 原位限制性内切酶消化
3.2 第二向电泳
3.2.1 制胶
3.2.2 电 泳
3.3 放射自显影
###4 图像分析
###5 RLGS 用到的其他内切酶
注意事项
来源:丁香实验