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限制性酶切标记基因组扫描检测基因突变实验

相关实验:限制性酶切标记基因组扫描检测基因突变实验

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

##一、材料

###1.封闭:偶发的损伤修复(repair of adventitious damage, RAD)

(1) 高分子质量基因组 D N A : 330 ug/mL 溶 于 T E 缓 冲 液(10 m m 〇l/L Tris, I

m m o l /L E D T A , p H 8.0)。储存于 4°C (见注释 1 和 2)。 2. D N A 聚合酶 I ( 4 U/fxL) (TOYOBO, Osaka)。 储存于一20°C 。 3 . 局 浓 度 缓 冲 液 (1 0 X H B ): 0. 5 mol/L Tris-H C l , p H 7. 4, 100 m m o l / L M g C l2, l m o I/L N a C l , 1 0 m m o l /L D T T 。储存于一20。。。 4. d C T P [a] S , d G T P [ 〇: ] S (A m e r s h a m ),储存于一20°C 。 5_ d d A T P , d d T T P (A m e r s h a m), 储存于一20°C 。 6. R A D 储 液 :混合 130 ML I O X H B , 13JUL I mol/L D T T , 30 fxL I m m o l / L d d A T P , 30 I m m o l / L d d T T P , 24 ;xL 10 m m o l / L d C T P [a] S 和 24 /xL 10 ( n m o l / L d G T P [a] S 。分装储存于一20° C 。 7•大口径吸头:切除0.2 m L 吸头约5 m m 长度。 2. 2 限制性酶切和同位素标记 1. (20 U / p L ) (T O Y O B O )。 储存于一2(TC (见注释 3)。 2. £ C0R V (20U /ML ) (T O Y O B O )。储存于一20°C (见注释 3)。 3. JVofI 添加物: 0.5 mol/L N a C U 20 m m o l / L M g C l 2, 0.065% 牛血清白蛋白 (BSA), 0• 065% Triton X-100, 4 m m o l / L D T T 。 混合 100 |uL 5 mol/L NaCl, 20 pL I mol/L MgCl2, 65 ML 1%BSA, 6.5 10% Triton X-100, 4 fxL I mol/L D T T 和 805 fxL H20 。储存于一20°C。 4. [〇r32P ] d C T P (3000 Ci/m m o l ; A m e r s h a m )。 5. [Qr32P ] d G T P (3000 Ci/m m o l ; A m e r s h a m )。 6 . 测序酶乂《 2.0(12 11//^ ; 1 1 3 8 , ( :1以打1紐(1)。储存于一20。 ( :。 7•终止液: 5 0 m m o l /L E D T A , p H 8 , 含 5 0 % 蔗糖和〇.5 % 溴 酚 蓝 ( B P B ) 及二 甲 苯 蓝 (xylene cyan〇l, X C )。储存于室温

###2 限制性酶切和同位素标记



###3 二维电泳

3.1 一 向 电 泳(1st D)

制备凝胶和原位消化所需要的装置如图2所示。

用于圆盘琼脂凝胶制备和原位消化的小型仪器设备。
1•用于分离1〜5 k b 片段的第一向 电 泳 缓 冲 液(10 X Boyer buffer): I mol/L Tris, 0.4 mol/L 乙酸钠, 0.36 mol/L NaCl, 40 m m o l / L E D T A , p H 8.15。 I. 8 L H 2O 溶解 242 g Tris, 109 g 三 水 ( 合)乙酸钠, 42 g N a C l,和 23. 4 g E D T A N a 2 • 2H 20 ,用 乙 酸 (IXbuffer 的 p H 为 8. 0 5 ) 调节 p H 至 8.15。用 0.45 硝酸纤维素膜过滤并储存于室温。 2•用于分离5〜12 k b 片段的第一 向 电 泳 缓 冲 液 (10 X marathon T B E buffer): 1.35 mol/L Tris, 0.45 mol/L 硼酸, 0.1 m m o l /L E D T A , p H 8.8。 1.8L H 2O 溶解 327 g Tris, 55. 6 g 硼酸, 0 •74 g N a 2E D T A . 2H 20 , 用 0 •45 pan 硝酸纤 维素膜过滤并储存于室温。 3 . 琼 脂 糖 浓 缩 胶 (0.6%): 2_ 5 g 蔗 糖 , 0_ 3 g Seakem Gold 琼 脂 糖 ( FMC), 5 m L 相 应 的 I O X —向 电 泳 缓 冲 液 ( Boyer或 marathon TBE),加 至 40 mL H2O 中。微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量的温水至起始重量。当温度降至 65°C ,用 0 •45 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 15 mL Falcon离心 管每管分装5 mL。储 存 于 4°C 。 4. 1〜5 k b 片段的琼脂糖分离胶(0 •9%): 10 g 蔗糖,〇• 9 g Seakem Gold琼脂糖 (F M C ), 0. 9 g Seakem GTG 琼 脂 糖 ( F M C ), 20 mL IOXBoyer 电泳缓冲液, 加水至200 mL。 微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量温水至起始重量。当温 度降至65°C ,用 0 •45 ^ x m 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 50 mL Falcon离心管每管分装30 mL。 储存于4°C (见注释4)。 5. 5〜12 k b 片段的琼脂糖分离胶( 〇.7%): I O g 鹿糖, 0.4 g Seakem G o l d琼脂糖 (F M C ) , I g Seakem G T G 琼 脂 糖 ( F M C ), 20 m L IOXmarathon T B E 电泳缓 冲液,加水至200 mL。 微波炉煮沸溶解。待完全融化后加适量温水至起始重 量。当温度降至65°C , 用 0.45 p m 硝酸纤维素膜真空过滤未溶解的颗粒。用 50 m L F a l c o n 离心管每管分装30m L。 储存于4°C (见注释4)。 6•有双滴定管夹的固定架。 7 . 注 射 器 (I m L 和 6 m L )。 8•针 头 (10 c m 长, 1 9 目,平头) 。 9 . 三通管:配注射器。 10• 桂 胶 管 ( 内 径 3 m m 和 5 mm)。 11.去头的吸头:切 除 0.2 m L 吸头距头5 m m ,距 尾 部 分 ,配注射器用。 12•DNA分子质量标准:混 合 3 //L l k b l a d d e r (500 ng/ML ; NEB), 3 0 fzL终止 液 , 6 7 ML H 20 。储存于 4°C 。
3.2 原 位 限 制 性 内 切 酶 消 化
2 . 3 . 2 原 位 限 制 性 内 切 酶 消 化 1. B P B 溶 液 (0.01%)。储存于室温。 2 . 反应管: 36 c m 长 ,内 径 2. 7 m m 的 Teflon管 接 到 3 c m 长 的 硅 胶 管 ( 内 径 3 m m )。管上做好连续的号码标签。 3. HinfI 缓 冲 液 (10X ): 200 m m o l / L Tris-H C l , p H 8.3, I mol/L NaCl, 100 m m o l /L M g C l 2, 10m m o l /L D T T 。储存于一2(T C 。


3.3 二 向 电 泳(2n d D )

4. 缓 冲 液 (2 0 U /fxL) (TOYOB)。储存于一20°C 。 2. 3.3 二 向 电 泳 (2n d D ) 1•剥离硅烧E S (R e p d -SilaneES, A m e r s h a m : 用于玻璃板包被的二氯二甲基硅焼 溶液)。 2 . 胶带: Scotch 3M 或其他型号。 3_ T B E 缓 冲 液 (5X ): 400 m m o l / L Tris, 445 m m o l / L 硼酸, 12.5 111111〇 1/1£0- T A 。 108 g Tris, 55 g 硼酸, 9. 3 g E D T A N a 2 . 2H 20 , 加水至 2 L 。用 0. 45 硝酸纤维素膜过滤,储存于室温。 4•甘油溶液(5 0 % ) : 等体积的甘油和水混合,储存于室温。 5 . 丙烯酰胺储存液(30%): 290 g 丙 烯 酰 胺 (99. 9 % 纯度)和 I O g i V , N '-亚甲基 双丙烯酰胺,加水至1000 mL,用 0.45 pm硝酸纤维素膜过滤,避光并储存于 4°C (见注释5)。 6 . 过硫酸铵:制备新鲜的1 0 % 溶液。 7. T E M E D /四甲基二乙胺。 8 . 水饱和正丁醇: 300 m L 正丁醇和等体积的水混合,吸取上层部分,存于喷雾 瓶 ,置于室温。 9 . 蓝色连接凝胶溶液:〇• 5 g Seakem G o l d 琼脂糖溶于100 m L 含 0. 0 5 % B P B 和 X C 染料的I X T B E 缓冲液,分装于3 个 Falcon 50 m L 离心管。储存于4°C 。 10•上样平台:塑料盘3 m m 厚 , 33 c m X l O c m 。

###4 放射自显影
2 . 4 放射自显影 1 . 干胶仪: BioHRad 583或同类型设备。 2 . 滤纸: 35〇 11\43〇 11, 0.7 111111厚。 ( 层析纸>1〇. 526,八如311^(: 11, 1'〇 1^〇)。 3•塑料保鲜膜(50 c m 宽) 。 4. X 射 线 胶 片 (35 c m X 43 c m ): FujiRx-U , Kodak BioMax M S 或同类产品。 5 . 增 感 屏 (35 c m X 43 c m ): Fujifilm G R E N E X H R -12 , Kodak BioMax M S 或同 类产品。 6. 3 5 Cm X 4 3 c m 胶片的曝光盒。 7. X 射线胶片洗片机

##二、方法

###1.偶发性损伤修复(「封闭」,「blocking」)

3 . 1 偶发性损伤修复(“封闭”,“blocking”} 1 . 熔 化 RAD储存液,配制封闭液:每个DNA样本混合〇.3 piL DNA聚合酶I 和 1.8 pL RAD储液。用移液器轻柔混合,置 于 冰 上 ( 勿振荡) 。 2•加2.1斗 R A D 封闭液到7 斗 D N A (〜2 吨)中。用带粗吸头的移液器轻轻混 合。 16°(:孵 育 3〇 111丨 11后,再 65。 ( :孵育3〇 111丨11(见注释1)
###2.限 制 性 酶 切 消 化 和 同 位 素 标 记

3 . 2 限 制 性 酶 切 消 化 和 同 位 素 标 记 1•加2.1 M L JVw I ,各 I / V0Z I 和 E c o R V 。用带粗吸头的移液器轻轻吹打 (10次) ,充分混合达到完全消化。 37°C 孵 育 3h 。 2. D N A 聚合酶放射性标记补平iVof I 5'黏 末 端 (Sequenase Ver. 2.0)。制备标记 储液 :每个反应混合 1. 6 斗 [Cr32P ] d C T P 和 L 6 M L [a-32P ] d G T P , 0 •2 1 mol/L D T T , 0. 3 p L Sequenase。加 3. 7 ( u L 标记储液至消化的D N A 中,移液 器混合充分。 37°C 孵 育 30 m i n 。 3 . 加 5 p L 终止液后,置 于 冰 上 ( 见注释6 ) 。 3-3 双向电泳 在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究 基 金 会 (Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划(The Biochemical H GeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶 电泳系统进行蛋白质突变体的研究,现在这 种技术被用于D N A 上。经过多次试验,我 已经在内径2. 4 m m 的 Telflon管中进行琼脂 糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发 现由于管内壁不平整,可使得在长时间的电 泳过程中,琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝 胶 由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和59 c m 0 •9 % 的 分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。 这种装置可以同时分析10个 D N A 样本。垂 直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子D N A 片段。此系统大大地减小了电泳的空间,并 降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶 的 量 ( 原来的系统每个反应需要使用Hinf I 图3 用于一向琼脂糖圆盘凝胶电泳的装 置 。 10 〇〇〇 U ,现 在 只 需 用 500 U ),因此使 R L G S 方法变得更为实用和经济 。 一 向的琼 脂糖圆盘凝胶系统和最新的大胶二向垂直电泳装置系统(10或 8 块胶)分别展示于图3 和图4。以上所有的装置都可以从Ohtsuka-Rikagaku (Hiroshima, Japan) 购置。 3.3.1 — 向电泳 3 . 3 . 1 . 1 琼脂糖圆盘凝胶的制备 —向电泳凝胶的制备过程如图5 所示。在同位素标记之前进行凝胶的制备。如果需 要研究两种类型的D N A (1〜5 k b 和 5〜12 kb),就需要同时制备两种凝胶。对 于 5〜 12 kb D N A 片段,也可制备更软的凝胶。 1 . 在微波炉中溶解分离胶和浓缩胶,并置于70°C 加热板上保温。 2 . 将接有三通管的6 m L 塑料注射器通过3 c m 长 硅 胶 管 ( 内径5 m m ) 与制备凝胶 的持胶器连接。 . 1 2 6
###3.双向电泳

在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究基 金 会(Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划(The BiochemicalGeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶电泳系统进行蛋白质突变体的研究,现在这种技术被用于 D N A 上。经过多次试验,我已经在内径 2. 4 m m 的 Telflon 管中进行琼脂糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发现由于管内壁不平整,可使得在长时间的电泳过程中,琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝胶 由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和 59 c m 0 •9 % 的分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。这种装置可以同时分析 10 个 D N A 样本。垂直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子 D N A片段。此系统大大地减小了电泳的空间,并降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶的 量(原来的系统每个反应需要使用 Hinf I

3.1 一向电泳
3 . 将持胶器的底部伸人分离胶溶液I c m 深,慢慢吸人分离胶溶液至距底部57 cm 处的第一条线( 见注释7)。 4 . 吸人后,保持约30s,再转移至有双夹的铁架台上,凝 固 lOmin。 5 . 将旋塞右转90°打开左边进口,小心移走管上带旋塞的注射器。 6 . 使用预热的带有平头针头的I m L 注射器灌分离胶至59 o n 处的第二条线。手指 轻敲持胶器的上端数次以保证凝胶的表面平整。凝固3min。 7 . 灌浓缩胶溶液至60. 5 c m 处的第三条线。手指轻敲持胶器的上端数次以保证凝 胶的表面平整。凝 固 lOmin。 8 . 用 I X —向电泳缓冲液充满持胶器。 9 . 通过直径为5 m m 的硅胶塞将持胶器放置于阳极槽中。 1 0 . 加 350 mL I X —向电泳缓冲液于底部槽。 11. 顶部槽置于底部槽上,并注人300 m L I X —向电泳缓冲液( 见注释8)

3.1.1 琼脂糖圆盘凝胶的制备
3. 3.1 .2 电泳 1 . 每条胶上10 含 1 哗放射性同位素标记的D N A (见注释9)。 2 . 每条胶上1〇 juL D N A 分子质量标准(150 ng)。 3 . 所用样品加完后,合上顶部槽盖,并连通电极和电源。 4•恒压电泳。小 D N A 片 段 (1〜5 k b ), 130 V , 19 h 后 140 V , 24 h (约 5800 V • h) 直M 溴酚蓝条带迁移了 50 c m 。对于大的D N A 片 段 (5〜11 kb), 70 V 电泳1 周 ( 约 11 200 V . h ) 直至染料X C 迁 移 50 c m (见注释10)。 3.3.1. 3 原位限制性内切酶消化 琼脂糖圆盘凝胶分离的N w I /Ec0R V 消化片段需要用常见的限制性内切酶如 扭 nf I 进一步酶切成更小的片段,之后再进行如图1 的第二步分离。图 6 所示为如何 回收所需凝胶部分,图 7 为原位消化的步骤。在 Teflon管中进行酶切反应可以大大减 少昂贵的内切酶的使用量,并使操作过程更简便,重复性更好。 1 . 关闭电源,拔出电极,揭开顶盖,吸走阴极槽的缓冲液。 2 . 从阴极槽中取出持胶器。用去离子水清洗胶的底部以去除放射性同位素( 注意 恰当处理具有放射性的废液)。 3 . 将含有D N A 分子质量标准的胶挤入50 m L Falcon离心管中。加人30 inL E B 溶 液 ( O.Sj^g/m L ) 染胶 20m i n 。 在紫外线下观察胶条并拍摄,用通明标尺来记录 各条分子质量标准条带之间的距离( 见注释11)。 4 . 假设当分子质量标准I k b 和 5 kb D N A 分别迁移至距底部8 c m 和 38 c m 时, 距底部7 c m 和 39 c m 之间的32 c m 长 度 ( 此部分两端分别含B P B 和 X O 的 胶将用于胶内酶切( 同理,对于大分子质量的D N A ,包 含 5〜12 k b 片段的距 底部7〜39 o n 之间的胶也用于酶切) 。在持胶器上距胶顶部7 c m 和 39 c m 处做 标记。 5•用I m L 配有去头吸头的塑料注射器吸取B P B 溶液,并缓慢通过B P B 溶液挤压 凝胶,当蓝色溶液到达第一条7 c m 线处,按 45°用手术刀切除挤出的凝胶。将 挤出的39 c m 凝胶转入装有20 m L IXHiraf I 缓冲液的 50 m L Falcon离心管 中,当 B P B 溶液到达39 c m 处 ,按 90°切断凝胶。 6•室温下在I X f f i n f I 缓冲液中平衡凝胶30m i n , 每 隔 IOmin更换缓冲液,期间 偶尔摇晃离心管。 7•将凝胶连同缓冲液转移至倾斜10°放置的托盘中。 8•在6 m L 注射器前装上去头吸头,并 用 3 m m 内径、 3 c m 长硅质套管将枪头连 到 2. 7m m 内径、 33 c m 长 的 Teflon管上。将胶条小心吸人Teflon管中,并尽 量除去凝胶中的缓冲液。 9•力600 p L 含 400 U H i n f I 和 0. 01% B SA 的 IX ffin f工缓冲液到2 m L 圆底离 心管,将溶液吸人Teflon管中,使 得 Hinf I 混合液浸没凝胶表面。 1〇 •移走注射器,用 3 c m 硅质套管将Teflon管首尾连接成环,放入尼龙袋中置于 37°C 孵 育 4 h (见注释12)
3.1.2 电泳

3.1.3 原位限制性内切酶消化

3.2 第二向电泳
3. 3. 2 第二向电泳 3.3. 2.1 制胶 在第二向电泳之前至少一天准备凝胶。利用图4 所示系统可同时制备1〇 块 (33 cm 宽, 46 c m 长 和 0.8 m m 厚)凝胶。丙烯酰胺溶液有毒,在凝胶配制过程中,注意戴塑
3.2.1 制胶

3.2.2 电 泳
胶手套。 1•仔细清洗玻璃胶板,用剥离硅烷处理倾斜一面的表面。 2•放好装置,并用粘胶带 (Scoth 3M ) 密封底部洞口( 见注释13)。 3 . 在烧瓶中混合348 g 3 0 % 丙烯酰胺储存液, 504 g 5X T B E , 23.3 g 5 0 % 甘油, 15 g A P S 和 1110 g 水以制备5.15%丙烯酰胺凝胶( I.25X T B E )。分装到两个 I L 真空烧瓶。我们发现配制试剂时,通过重量比利用量筒测量体积更准确。 这种准确性在保证电泳的可重复性方面非常重要。 4•真空泵抽出溶液中的气体,开始时操作要柔和。摇晃烧瓶,抽真空直至没有气 泡产生。 5 . 加 人 210斗 T E M E D 到 I L 丙烯酰胺溶液中,混 合 均 匀 ( 见注释14)。 6 . 从装置的底部进口通过硅质套管将凝胶溶液立即注人电泳装置中。当溶液到达 距玻璃板顶端I c m 处用夹子夹住进口处套管。 7 . 用水饱和的正丁醇封住液面( 见注释15)。 8•聚合I h 后 ,用 I X T B E 代替凝胶上层溶液。 9 . 用保鲜膜封住凝胶的T B E 溶液,室温放置至使用。凝胶在室温下至少稳定放置 5 天。避免凝胶的顶部干掉。 3 . 3. 2. 2 电 泳 1 . 融化蓝色连接琼脂糖,将容器置于70°C 的加热板中。 2. Hinf I 消化4h 后 ,将每一个胶条挤人装有20 m L I X T B E 的 50 m L Falcon离 心管中。 3 . 平 衡 IOmin后 ,弃去缓冲液,将凝胶条转移至凝胶上部上样平台中,用尺子拉 直胶条,移至平台的边缘。 4 . 用连接琼脂糖堆积凝胶顶部至玻璃板的倾斜处。 5 . 用刮炉将胶条沿胶板滑到玻璃板上。 6 . 在胶条上覆盖足够的琼脂糖,凝 固 lOmin,移走平台。 7 . 在每个槽中加人2.5 L I X T B E 缓冲液,移除封洞的胶带,让凝胶和缓冲液 接触。 8•接通电极供电,电 泳 150 V , 40h ,直至分子质量标准染料X C 移 至 35 c m 处 (见注释16)。 3. 3. 3 放射自显影 1 . 电泳结束后,关闭电源,拔出电极。 2 . 移走电泳缓冲液。 3 . 放平装置,拿走塑料盖板。 4 . 用刮伊缓慢撬开顶部的玻璃板。 5. 在凝胶上放置一块滤纸(35 c m X 43 c m ,比凝胶宽2 c m ) , 轻按使凝胶附于滤纸 上,用手术刀切除凝胶的3 c m 部分。 6 . 捏住滤纸的边缘,迅速翻转将凝胶覆盖于干胶器上的另外一张滤纸上( 凝胶置 于上方),用保鲜膜覆盖凝胶,尽量避免折痕和气泡。
3.3 放射自显影

###4 图像分析
图 8 所 示 为 B A L B /c 小 鼠 的 R L G S 图谱的数字图像。在此方法中,通过放射自显 影方法观察末端标记的D N A 片段。点的密度 代 表 D N A 的拷贝数目。除了来源于性染色体 片 段 和 核 糖 体 D N A 等有多拷贝的片段之外, 一 张 R L G S 图谱上的大部分点的密度代表常染 色 体 D N A 片段的两个拷贝。对基因组突变的 检 测 主 要 是 通 过 对 D N A 片 段 长 度 改 变 的 观 察 ,如 插 人 或 缺 失 或 B 切 位 点 碱 基 的 突 变 。 通过查找只出现在子代而不在亲代出现的新 的点,或 者 在 子 代 只 有 一 半 浓 度 ( 一个拷贝) 而亲代为两个拷贝的点,突变也可以得到鉴 定 。如 果 从 iV〇i I 位 点 到 最 近 的 I 或 &〇 R I 位 点 的 距 离 发 生 改 变 ,突变的片段在 凝胶上将会发生位移。突变的片段发生位移 的 情 况 如 图 9 所 示 。在 某 些 情 况 下 ,发生突 变 的 片 段 未 必 能 在 每 一 块 凝 胶 上 发 现 ( 尽管 可能出现在不同的胶上) ,如 果 Not I 位点发 2kb- 小鼠、 图谱 图 8 BALB/c小鼠RLGS图谱的数字图像。 根据克隆位点的序列信息确定每一维上的片 段大小。 生缺失或者碱基替代,那么这个点就不会出现在凝胶上。无 论 如 何 ,正常的点的密 度理论上应该减少5 0 % 。现在已有计算机程序来分析复杂的双向电泳图谱。计算机 辅助图像分析检测每个点的存在与否以及任何密度上的改变;因此,我们能高效地检测 基因组的缺失、扩增 、插人 、重组 。图 1 0 是我们在小鼠研究中检测到的基因突变的 例子。 3.5 RLGS用到的其他内切酶 内切酶iV〇«I 、 E c o R I 和 H i n f I 的组合,使我们得到了人类和小鼠( 以及大鼠) D N A 点最平均分布的图谱。据我们的经验,目前可以用于检测人类和小鼠的最可靠的 标 记 内 切 酶 是 I (我们检测10 000块胶后得出结论) 。第 二 个 酶 ( 在标准方法中; E c o R I ) 、 PsfI (O T G C A G ) 和尸加1[ (C A G + C T G ) 也可以使用。至于第三个用 于原位消化的酶, M 6〇 I ~undefined G A T C ) 、 B c m H I (G +G A T C C )、 I 、和 P ™ n 都可 用 ( 尽 管 I 较贵) 。这些酶可以随意组合。 R L G S 在其他物种上同样适用,而且如 果研究物种的基因组比人类或小鼠小,那么操作更容易。我们已经检测了以下物种: (1) Medaka (—种鱼;基因组大小为 I X 109bp): N o f I 、 E c o R V 、和 Hinf I 组合, (2) Sacchromyces (酵母; 3X 107bp): Hiwdin (A ^A G C T T ; 作为标记内切酶,仅仅

###5 RLGS 用到的其他内切酶
图 9 限制性图谱为等位基因位点的各种空间构象提供可能的解释。 C 标 记的片段代表常规等位基因, V I、 V2、 V3 代表突变体。标记的限制性位 点 : N= JV toI, H= H k f I , E= & 〇RV 。阴影长方形标记代表缺失图 1 0 发生突变的部分位点的特写。箭头所指为检测到的 突变位点。突变位点用M标记。在最左栏,突变的杂合子 位点消失

注意事项

1•完整的高分子质量D N A 是非常黏稠的,很难通过移液器定量。这种情况下,用 E c o R V 消化基因组D N A 。使用5 U 的酶在100 (xL I X 高缓冲液, 37°C 下消化大 约 5〜1 0 叫 D N A Ih。加 人 5 mol/L N a C l 和 250 fxL乙醇沉淀D N A 。离心回收 D N A ,并溶解在I O O jU L T E 中。通 过 0026。测定浓度。同样乙醇沉淀,溶解于 T E 中 使 其 浓 度 为 300 pg/V U 利 用 这 些 部 分 消 化 的 D N A 代替高分子质 量 D N A 。 2 . 除非特殊说明,所以缓冲液和溶液都是用电阻值为18 M n 的 Milli-Q 水配制。 去离子水或者蒸馏水同样可以使用。 3. N E B 生产的内切酶(iVof I 、 E c o R V 和 H i w f I ) 也可使用。所有的酶都储存于 没有除霜的一20°C 冰箱。 4•在煮沸前后,称量琼脂糖溶液的重量,以便煮沸后用水补充至原重量。 5 . 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺通常含有金属离子,可以向每升储存液中加人I g 离子交换树脂( AmberliteIRN-150L) 搅拌过夜达到纯化。每几个月应重新制 备新鲜溶液。 6•在同位素标记之前消化物可在4°C 保存数天,但不能冷冻。 7•仔细检查凝胶有无气泡,如果出现,应重新配制。 8 . 理论上,反应的终体积应为21.9 ,但是实际中大约会降低至2 1 斗 或 更 少 。 9 . 检查凝胶缓冲液中有无气泡,如果有,则用 I m L 配有平头针头的注射器轻轻吸 除。 10. 温度越高,染料和D N A 片段移动得越快,那么电泳时间的长短也不同。如果 时间仓促,短片段的电泳可以在130 V , 2h 后改用200〜250 V 。长片段可以 在 100 V , 2〜3h 后加到150 V 。总之,采取低电压会得到更高分辨率和更清 晰的斑点。 11. 防止紫外线辐射,需戴安全面具。 12. 在每个离心管上做好标记。 13. 玻璃胶板上避免粘有油脂和灰尘,以免制胶时形成气泡。 14•调节TEMED的量,以便凝胶在灌注后IOmin凝固。

来源:丁香实验

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