DNA重组分子的转化

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DNA连接与转化

1实验原理

DNA重组 分子 在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA分子 的转化。对于不同的受体细胞，往往采取不同的转化战略。

1.1 DNA重组分子的常用转化方法

1.1.1 Ca 2 诱导转化

1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌 能够吸收l噬菌体DNA，此后不久，Cohen等人用此法实现了质粒 DNA转化 大肠杆菌 的感受态细胞，其整个操作程序为：1)将处于对数生长期的细菌 置入0℃的CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2 使细胞膜 磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态;2)此时加入DNA，Ca 2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶 (DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌 细胞膜 的外表面上;3)经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg 2 的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2 与CaCl2 又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，Hanahan除了用CaCl2 和MgCl2 处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜 (DMSO )和二巯基苏糖醇(DTT)进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca 2 诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。

1.1.2 PEG介导的细菌原生质体转化

在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌 、霉菌甚至植物 等真核细胞有效。只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。

1.1.3电穿孔驱动的完整细胞转化

电穿孔(Electroporation)是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。具体操作程序因转化细胞的种属而异。对于大肠杆菌来说，大约50ml的细菌与DNA样品混合后，置于装有电极的槽内，然后选用大约25微法拉第、2.5千伏和200欧姆的电场强度处理4.6毫秒，即可获得理想的转化效率。虽然电穿孔法转化较大的重组质粒(>100Kb)的转化效率比小质粒(～3Kb)低一千倍，但这比Ca2 诱导和原生质体转化方法理想，因为这两种方法几乎不能转化大于100Kb的质粒DNA。对于几乎所有的细菌均可找到一套与之匹配的电穿孔操作条件，因此电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程序。

1.1.4接合转化

接合(Conjugation)是指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由结合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码。在DNA重组中常用的绝大多数载体 质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合方法转化受体细胞，然而如果在同一个细胞中存在着一个含有接合功能区域的辅助质粒，则有些克隆 载体 质粒便能有效地接合转化受体细胞。因此，首先将具有接合功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的细胞中，然后将这种供体细胞与难以用上述转化方法转化的受体细胞进行混合，促使两者发生接合作用，最终导致重组质粒进入受体细胞。

1.2转化率及其影响因素

转化率是转化(包括感染)效率的评估指标，通常有两种形式表征转化率，一是在待转化DNA分子数大于受体细胞数的条件下，转化细胞与细胞总数之比，例如在标准条件下，利用Ca2 诱导法转化质粒DNA的最大转化率为10-3 ，即平均每一千个受体细胞中有一个细胞接纳了质粒DNA，如果假定处于感受态的受体细胞能100%地接纳DNA分子，则这种转化率直接反应了受体细胞中感受态细胞的含量;转化率的另一种表示形式是在受体细胞数相对于待转化DNA分子数大大过量时，每微克DNA转化所产生的克隆数。由于在一般规模的转化实验中，所观测到的每个受体细胞只能接纳一个DNA分子，因此上述转化率的定义也可表征为每微克DNA进入受体细胞的分子数。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108 /mg DNA，其含义是每微克pUC18只有108 个分子能进入受体细胞，一微克pUC18中共有6.02×1017 /2,686×660=3.4×1011 个分子，也就是说，每3,400个pUC18分子中只有一个分子进入受体细胞。如果能够准确确定转化一微克pUC18所用的受体细胞的总数，则上述两种转化率是可以换算的。

1.2.1转化率的用途

利用已知的转化率和重组率参数可以帮助设计DNA重组实验的规模。例如，某一连接系统的重组率为20%，转化率为107 /mg DNA，经体外切割与连接处理后的载体DNA或重组分子的转化率比直接从细菌中制备的载体DNA低100倍，若载体DNA和重组DNA 分子的转化率差异忽略不计，则欲获得104 个含有重组DNA 分子的克隆，至少应投入0.5mg的载体DNA，其计算方法如下：104 /20%×10-2×107 。按外源DNA片段与载体DNA分子数十比一的要求，即可推算出外源DNA片段的用量。如果转化培养液全部涂板筛选，理论上可形成5×104 个转化克隆，若使每块平板上平均含有1,000个克隆，则需涂布50块平板。涂布过密会给后继筛选带来很大困难，涂布太稀，既浪费又给筛选造成不必要的麻烦。

1.2.2转化率的影响因素

转化率的高低对于一般重组克隆实验关系不大，但在构建基因文库 时，保持较高的转化率至关重要。影响转化率的因素很多，其中包括：

(1)载体DNA及重组DNA：

载体本身的性质决定了转化率的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化率明显不同。载体分子的空间构象对转化率也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往具有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低10-2 。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化率低。对于大于30kb的重组质粒，即使采用电转化的方法也很难进行转化。

(2)受体细胞：

受体细胞一般要求是具有限制重组缺陷性，而且应与所转化的载体DNA性质相匹配，如pBR322转化大肠杆菌JM83株，其转化率不高于10 3 /mg DNA，但若转化ED8767株，则可获得106 /mg DNA的转化率。

(3)转化操作：

受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。对于Ca2 诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2 处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12-24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。对于原生质体转化而言，再生率的高低直接影响转化率，而原生质体的再生率又受诸多因素的制约。在一次转化实验中，DNA分子数与受体细胞数的比例对转化率也有影响，通常50-100ng的DNA对应于108 个受体细胞或原生质体，在此条件下，加大DNA量并不能线性提高转化率，甚至反而使转化率下降。而采用不同的转化方法则将获得不同的转化率。

(4)试剂纯度与器皿的洁净度：

转化过程中，所用的试剂(包括水)必须是高纯度的。在Ca 2+ 法转化中采用不同来源的CaCl2，转化率差异非常大，实验中采用国产分析纯的CaCl2 制备的感受态细胞，其转化率与进口的同类型试剂相比要低10-2 左右。同样对于保存细胞添加的抗冻剂甘油也应采用高纯度，在感受态细胞制备过程的所用器皿尽量酸洗后乙醇洗涤，超声后用超纯水淋洗。

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2实验步骤

2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)用牙签挑取少许大肠杆菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃培养12～16h。

(2)挑取单菌落接种于30ml LB液体培养基中，37℃下培养12～16h。

(3)按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于50mL LB培养基中。

(4)37℃摇床培养1.5～2.0h至OD600 为0.4左右，置冰水浴预冷。

(5)转移至50ml预冷的离心管中，4℃恒温，6 000转/分离心10min。

(6)弃尽上清液，将菌体置于冰水浴中，用30ml预冷的100mmol/L CaCl2 -MgCl2 混合液轻轻混匀洗涤一次。

(7)4℃恒温，6 000转/分离心10min。

(8)弃尽上清液，将沉淀用1ml预冷的CaCl2 -甘油混合液重新轻轻悬浮。

(9)100mL/管分装至预冷的Eppendorf管中(冰水浴中操作)，迅速置�80℃冰箱冷冻保藏。

2.2 大肠杆菌的转化

(1)从-80℃冰箱取一管大肠杆菌感受态细胞，手心融化，迅速置于冰水浴中。

(2)加入5ml DNA或10ml连接液，轻轻混匀，冰水浴中放置30min。

(3)取出混匀后42℃水浴脉冲2min。

(4)快速转移至冰水浴中放置1～2min，加入900ml LB培养基，37℃摇床复苏培养1～1.5h;

(5)吸取100ml转化液涂布于适当的LB固体培养基上;

(6)37℃倒置培养12～16h，挑选出单菌落划线扩增。