外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞的方法

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一、 实验目的

学习外源DNA导入原核生物细胞的方法

二、 实验内容

热激处理将外源质粒 DNA导入原核细胞。

三、 实验原理

利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。

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四、 实验方法与步骤

1、 制备含有Amp抗生素的LB平板。

2、 取一个1.5ml离心管，加入100&mu;l感受态细胞悬液，置冰上：加入20ul质粒T+G(提取的质粒DNA稀释500X)，用移液器 轻柔混匀。冰上静置20min。

3、 42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。整个过程不要振荡菌液。

4、 加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌 恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

5、 取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。

6、 待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。

7、 计算转化率

8、 统计每一个培养皿中的菌落数。

9、 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

10、 转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积;

11、 转化频率(转化子数/&mu;g质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(&mu;g)