大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化

实验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

实验原理

转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。

转化中的受体细胞： 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。

转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法

感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。

转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。

本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。

影响转化率的因素

细胞生长状态和密度。

转化的质粒 DNA 的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。

离心设备

实验试剂

大肠杆菌DH5α

LB培养基，

0.1mol/LCaCl₂溶液（预冷）

氨苄青霉素

pUC18质粒

实验步骤

菌株活化:

1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时

2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时

3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD₆₀₀＝0.3－0.4

感受态细胞制备:

4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min

5.4000rpm离心5min,弃上清

6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl₂,悬浮沉淀，冰上预冷10min

7.4000rpm离心5 min,弃上清

8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl₂,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存

外源DNA的转化:

9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min

10.于42℃水浴90S

11.冰上放置2min

12.加入800μlLB液体培养基于37培养1小时

13.将培养液均匀涂布在含Amp 的培养基平板上

14.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果

对照组

对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

实验结果