miRNA主要研究技术

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解读miRNA （MicroRNA）

尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序 、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。

下表介绍了miRNA 研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。

问题目的研究方法应用

有哪些miRNA表达?miRNA表达情况深度测序 &生物信息学分析

生物信息学分析预测可能的miRNA ，进一步验证发现新的候选miRNA

miRNA 何时表达?在哪里表达?表达差异?miRNA表达特征miRNA芯片，磁珠流式细胞miRNA表达谱

qPCR对hit miRNA进行验证，Northern Blot，原位杂交等发现差异miRNA，为进一步功能研究、诊断，预后判断，疗效检测等奠定基础

miRNA控制哪些基因?这些基因功能?所在信号通路?miRNA功能分析生物信息学分析

qPCR对hit mRNA进行验证，Western Blot等方法检测蛋白表达水平

转入miRNA mimics观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象(miRNA低表达情况)

转入miRNA antagomirs观察相应mRNA&蛋白水平变化以及相关现象(miRNA低表达情况)机理研究，功能研究

miRNA如何控制靶miRNA确定结合位点生物信息学分析miRNA结合靶mRNA 3ˊUTR的可能序列

构建包含miRNA结合位点(3ˊUTR)以及位点突变的萤光素酶报告载体进行验证机理研究

miRNA功能(与特定疾病、表型的关系)miRNA功能分析细胞水平：过表达及抑制实验(见前)，观察表型及现象变化以及上下游通路变化

动物模型：过表达及抑制实验(见前)，观察表型及现象变化以及上下游通路变化

临床组织样本，检测miRNA表达情况与疾病相关性功能研究

miRNA应用于诊断诊断选择疾病相关的一个或一组miRNA，或结合其它基因水平变化，进行q-RCR等检测诊断，预后判断，疗效检测

miRNA应用于治疗治疗转入合成的小分子miRNA模拟物(miRNA低表达情况)或拮抗剂(miRNAG高表达情况)治疗

miRNA主要研究技术

深度测序 抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及可能的新miRNA(miRNA-cadidate new)，并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。

miRNA芯片 利用miRNA芯片(例如Agilent miRNA芯片)，可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。

q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长;后者采用通用引物，时间短，通量较大。

Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉(抑制、敲除)等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。

萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体(例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统)，通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。

miRNA的研究方法还有很多，例如磁珠流式细胞仪分析miRNA表达谱，Northern Blot或核酸原位杂交检测miRNA的表达，miRNA克隆、测序等等。另外，在miRNA研究中，随着高通量测序、芯片的技术不断发展，另一个重要的工具--生物信息学分析发挥着越来越重要的作用。