实验高手谈siRNA引物设计经验

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siRNA 的设计是决定RNA干扰实验成功与否的关键步骤，然而并非每个siRNA都能有效引发基因沉默，因而siRNA的经验总结尤为重要，siRNA的设计工具也应运而生。因此，生物帮小编总结了部分帮友的成功经验供大家参考。

经验1：如果是自行设计siRNA 的话，一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以期提高成功率。据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达(减少75%-95%以上的mRNA)，一半以上的几率能达到50%的沉默效果。

经验2：siRNA 的反义链3'端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNAse会切除末端的G。

经验3：多个siRNA s位点最好分散分布在mRNA全长上。没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。不过，也有报道说，如果可能，最好能避开起始的50-200个碱基，以避开潜在的调控蛋白结合位点。

经验4：避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里BLAST一下，www.NCBI .nlm.nih.gov/BLAST ，和其他基因有16个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。

经验5：GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。有较多选择时留意。不要有连续9个以上的GC。也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于siRNA双链上只有一条链会结合RISE上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5' 端以GC开头，且5'端1-4个碱基GC含量高，且16-19位碱基GC含量低的序列得到的siRNA反义链5'端GC含量低3'GC含量高(也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU)，使得反义链比较容易正确结合RISE，因而基因沉默效果比较好。

经验6：如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5’GN(19)，后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中j减出现连续的U/A。

经验7：芝加哥大学的Anne Cahill这样说：“我比较喜欢采用siSearch 网站来设计shRNA.。我喜欢是因为它可以根据一些列公开的设计标准返回一个评分。我并不相信某一个网站或者某一类设计法则是完美的，我曾经试过8个:siRNA设计网站，输入同一个序列，希望找到一致的目标位点，不过结果令人绝望。所以我不会仅仅盲目的选择siSearch评分最高的的序列，我会尝试其他标准比如预测反义链二级结构和和目标mRNA上的定位，同时再看看RNAi Consortium或者RNAi Codex有没有我的目标序列。”

准备在体外转录的RNA干扰，siRNA表达载体，或PCR生成的siRNA表达盒，必须准备适当的模板。这些模板设计基于Web的工具可用于以下Ambion公司包/产品：siRNA沉默构建试剂盒、pSilencer siRNA表达载体、快速的沉默siRNA表达盒试剂盒、siRNA沉默的鸡尾酒套件(核糖核酸酶)。