基因组文库构建步骤和操作需知

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DNA文库的构建在物种 基因组学研究、基因表达调控、基因片段分离和提取等实验中具有重要作用。本文介绍基因组文库的构建步骤和操作中需注意的因素以及BAC 提取DNA的两种方案。

一、分离基因组 DNA(gDNA)

毫无疑问，高质量的基因组DNA对于基因组文库 构建是至关重要的。需要通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。

二、处理基因组 DNA

根据研究目的，研究者需要选择合适的载体 。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体，合适的片段长度大约为40kb;对于BAC载体，合适的片段长度平均为120kb-300kb。

构建黏粒基因组DNA文库，需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用胶回收试剂盒回收DNA。

构建BAC基因组DNA文库，需要将基因组DNA用限制性内切酶(常用EcoR I、BamH I或者Hind III)来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段(比如100kb-150kb)，随后透析回收DNA。

需要注意：

(1)电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。

(2)电泳以后，应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间，否则会显著降低克隆效率。

(3)回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。

三、载体的选择

目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体(P1人工染色体)、BAC载体(细菌人工染色体)和YAC载体(酵母人工染色体)。选用何种载体可以参考如下几个因素：

1、目标区域的大小：

如果基因组的目标区域很小(小于50kb)，那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，可以方便的构建黏粒载体文库。

如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒。

如果目标区域非常大(大于250kb)，那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难。

表1 各种载体的比较

载体 容量(kb) 宿主 导入细胞方式

黏粒 30-45 大肠杆菌 转导

P1 70-100 大肠杆菌 转导

PAC 130-150 大肠杆菌 电转

BAC 120-300 大肠杆菌 电转

YAC 250-400 酵母 转化

2、筛选文库的难易程度：

黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。

3、载体拷贝数的考虑：

当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性;而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统，CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。

四、将基因组DNA片段连接入载体

使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。许多商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。选用连接快、效率高的连接酶，连接反应体系以100μl为宜。

注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。

五、将重组载体转入宿主细胞

如果构建黏粒文库，需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染。挑出重组子，鉴定插入片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话， 就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。

如果构建BAC文库，应选择电转法，将上述连接产物转入受体菌，涂板长出克隆。获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。如果文库大小合适，就可以进行后续操作了。

六、文库克隆数的确定

基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：

N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。

举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp， 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为

N = ln (1 - 0。99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = 138，298

技术支持资料：

材料

缓冲液和溶液

- 碱裂解液I ， 4°C

50 mM 葡萄糖

25 mM Tris-Cl (pH 8。0)

10 mM EDTA (pH 8。0)

配制碱裂解液I 约100ml，灭菌，保存在四度。

- 碱裂解液II，新鲜配置，室温保存

0。2 N NaOH (从10N的NaOH新鲜制备)

1% (w/v) SDS 碱裂解液II应该新鲜配制，室温保存。

- 碱裂解液III， 4°C

5M 醋酸钾，60ml

冰醋酸，11。5ml

SDW，28。5ml - 酒精

- 70%酒精 - 异丙醇 - 酚：氯仿(1：1， v/v)

- 醋酸钠 (3M，pH5。2)

- STE，4°C

10 mM Tris-Cl (pH 8。0)

0。1 M NaCl

1 mM EDTA (pH 8。0)

- TE (pH 8。0)

10 mM Tris-Cl (pH 8。0)

10 mM EDTA (pH 8。0) 载体与菌株 BAC转化的大肠杆菌

培养基和抗生素 含12。5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基

酶和缓冲液

溶菌酶

RNaseA，不含DNase

限制性内切酶和相应缓冲液

核苷酸/寡核苷酸

用于脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis)的DNA

标准参照物

凝胶/点样缓冲液

脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gels，或者0。5%琼脂糖凝胶) 离心机/转头/离心管

其他 37摄氏度摇床

1。BAC DNA大量提取方案 (参考文献：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition)

此方案适合从500ml的菌液中提取BAC DNA，一般可以产生20-25μg纯化的DNA。

方法

1。将50μl BAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12。5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 震荡(280rpm)培养12到16小时。

2。2500g，4℃，离心15min，收集菌体。

3。用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀。按步骤2方法离心收集细菌。

4。用24ml含RNase(100μg/ml)的碱性裂解液I溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为1mg/ml。

5。加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰裕5min。

6。加入24ml冰预冷的碱性裂解液III，盖紧瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，置冰上5min。

7。15000g，4℃，离心10min，将上清转移到另一离心瓶中，弃沉淀。

8。加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀。3000g，室温离心15min。

9。将水相移至另一离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。

10。15，000g，室温离心15分钟，回收核酸沉淀。

11。弃上清，用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。

12。弃乙醇，风干使乙醇挥发殆尽。

13。小心将BAC DNA沉淀溶于0。2ml TE (pH8。0) 中。

2。BAC DNA的小量提取 (参考文献：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition)

此方案适合从5ml菌液中提取BAC DNA，一般可以产生0。1-0。4μg的BAC DNA。

方法：

1。挑取单菌落接种至5ml含12。5μg/ml氯霉素的LB培养基中，37℃剧烈震摇过夜。

2。2000g，4℃，离心5min，收集菌体。

3。在每个离心管中加5ml预冷的STE，用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤2离心收集细菌。

4。将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中。将菌体转移至预冷的微量离心管中，置于冰上。

5。向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II。轻轻翻转数次，将离心管置于冰上。

6。向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III，轻轻翻转数次。将离心管置于冰上5min。

7。在微量离心机上以最大速度4℃离心5min，除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入900μl异丙醇，轻轻翻转数次离心管，混匀。

8。立即在微量离心机上室温下最大速离心5min，使核酸沉淀。弃去上清，用1ml 70%乙醇小心漂洗。室温下离心2min，吸去乙醇。室温干燥沉淀5-10min后，将沉淀溶于50μl TE(pH8。0)中。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

cDNA文库在鉴定某些细胞的基因表达状态中具有较大的优势，因而成为研究中最为常用的基因文库。通常情况下，cDNA文库中的宿主细胞为大肠杆菌E.coli，实验过程中需注意提高连接效率，才能确保文库构建成功。