质粒DNA的转化操作步骤

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质粒 DNA的转化

【原理】

转化是将外源DNA分子 导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶 和甲基化酶(R-，M-)。将对数生长期的细菌 (受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜 、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子 进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。

本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌 细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

本实验是将人Bcl-2重组 质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组 质粒的工程菌。

含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。

【试剂与器材】

1.LB液体培养基 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。

2.LB固体培养基 LB液体培养基中加1.5%琼脂 粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

3.0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。

4.氨苄青霉素 用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。

5.人Bcl-2重组质粒 它是EcoR Ⅰ单酶切的pBluescriptⅡ KS(-)载体 与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA重组而成的，大小为4 861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体 。因此用EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。

6.大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌

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