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针对RNA酶的一些注意事项

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防止RNA酶污染的措施:
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3、 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5、 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6、 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
8、 加样原则是DNA最后加,其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染。
9、 普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系,最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。
常用的RNA酶抑制剂:
1、 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2、 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3、 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4、 RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5、 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
附确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法:
  按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别, 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

(责任编辑:大汉昆仑王)
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