异常凝血酶原单克隆抗体的制备与鉴定

凝血酶原是由肝脏合成的依赖维生素K的凝血因子。异常凝血酶原(Abnormal Prothrombin,APT)和凝血酶原的化学结构极其相似，区别在于：APT分子氨基端的特定位置上的谷氨酸残基未经羧基化，因而缺乏结合钙离子的结构基础，在一般凝血试验中无凝血活性。自从1984年Liebman等观察到原发性肝癌患者血浆APT水平显著升高，APT与肝癌的关系受到关注，其临床应用价值受到重视，测定方法不断改进。由于单克隆抗体建立的酶联法受外界因素影响小，可直接测出酶蛋白的含量，特异性强，灵敏度高，操作简便，是一种理想的检测方法。本试验旨在研制出抗APT的单克隆抗体，以检测出人血浆中APT的水平，建立灵敏、特异的检测方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　免疫用抗原：经生化处理，从服用华法令的羊血浆中提取、纯化APT，经SDS-PAGE鉴定为单一区带，分子量为72 kD，并与已知抗体发生特异性反应。

　　1.2　杂交瘤细胞的制备：用纯化的APT免疫Balb/c小鼠，共3次，每次间隔2 w，200 μg/(次只)，免疫第3次后10 d尾静脉取血测效价，效价达1∶8以上。融合前3 d腹腔注入APT加强免疫。取免疫小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞在50%PGE作用下融合，HAT培养液选择性培养。

　　1.3　克隆和检测：采用间接ELISA法，对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，选出与APT反应阳性的杂交瘤细胞。克隆化采用显微镜操作法，用特制的弯头毛细管在倒置显微镜下吸出单个杂交瘤细胞后，逐个放入预先加有饲养细胞的培养板小孔中培养。

　　1.4　单克隆抗体的制备：将杂交瘤细胞1×10⁶接种于Balb/c小鼠腹腔中制备腹水。

　　1.5　单克隆抗体亚类的鉴定：将单抗培养上清液浓缩，与抗鼠IgG亚类血清作双扩散试验。

　　1.6　免疫转印：APT经SDS-PAGE分离，在电转移系统中将凝胶蛋白转移至硝酸纤维素膜上，分别与各株单抗反应，浸入辣根过氧化物酶标记的IgG，最终以联苯二胺系统显色［见：顾方舟主编.淋巴细胞杂交瘤技术的应用.北京：人民卫生出版社，1985：23-25］。

　　2　结果

　　2.1　杂交瘤细胞株的建立：含阳性血清小鼠的脾脏细胞与NS-1细胞融合，悬于HAT选择性培养基中接种于24孔和96孔板，5 d左右见有明显的克隆生长，取上清用间接ELISA法重复筛选后，克隆化，获3株阳性细胞。将培养上清液浓缩后进行亚类鉴定，3株细胞系皆为IgG1，染色体计数结果为80～110(每细胞系统计10个细胞)，杂交瘤细胞染色体数均超过其亲本染色体数，为二者之和。

　　2.2　单克隆抗体的纯化：小鼠腹水中除含有单抗外，还含有清蛋白、小鼠自身Ig及其他血清蛋白、脂肪，故纯化腹水中的单抗十分必要。我们采用辛酸法［见：叶群瑞.一种简便、快速、量大的辛酸纯化单抗法.生物化学与生物物理进展，1991；18(1)：60］，通过硫酸铵沉淀，获得纯度较高的单抗，通过SDS-PAGE检测，由两个亚基组成，分子量分别为26 kD 和50 kD。

　　2.3　单克隆抗体活性的鉴定：抗原APT经过SDS-PAGE后，进行转移电泳，用丽春红S染色硝酸纤维素膜，证实抗原已转移到膜上并呈现出单一蛋白带，与3种单抗反应后，膜上出现棕色的与抗原APT特异结合的单克隆抗体带，与正常凝血酶原及其他血浆蛋白无交叉反应。

　　3　讨论

　　APT作为一种新的肝癌标志物对肝癌的早期诊断及预后具有重要的意义，对甲胎蛋白(AFP)低浓度或阴性的肝癌患者有较好的诊断价值，二者的联合应用可进一步提高肝癌的检测率。单克隆抗体是抗单一抗原决定簇，可避免与其他抗原产生交叉反应，因此用单抗所建立的APT检测方法具有特异、灵敏、准确的优点，避免假阳性及假阴性，适于临床诊断。本文所建立的抗APT单抗方法，周期短，从细胞融合到小鼠产生腹水仅需52d，抗体效价高，阳性结果稳定，重复性高，为进一步建立灵敏的APT检测方法奠定了基础。

　　作者简介：曹纯章，女，30岁，生物化学在职博士生；

　　王维忠，男，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学研究