单克隆抗体的制备与鉴定方法

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摘要：

从人脐静脉分离的内皮细胞经培养后免疫 Balb/c小鼠，利用小鼠杂交瘤技术，建立了一株持续分泌抗人内皮细胞单克隆抗体的杂交瘤。对其进行了较系统的鉴定，其抗体类别为IgG1。该单抗特异性地识别人内皮细胞，而与血细胞无交叉反应。

关键词：单克隆 抗体，内皮细胞

前言：

血管内皮细胞具有多种生理功能，参与机体的凝血，免疫 ，物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动。因为血管内皮细胞损伤已成为许多疾病发生发展的基本病理过程，外周血液中内皮细胞数目的变化是血管受损的重要标志之一。本实验旨在研制一人内皮细胞的单克隆抗体，研究血管内皮细胞的生理功能，及应用于临床内皮细胞的检测。

1.材料与方法

1.1人脐静脉内皮细胞的培养

内皮细胞的培养

-)所须试剂及溶液的配制及保存。(所须水全用合格的去离子水 )

1)Hank,s液

用途：用于保存标本

配制：500ml

称：Nacl 4 g KCL 0.2 g

MgSO4.7H2O 0.1 g Na2HPO4.12H2O 0.067 g

KH2PO4 0.03 g CaCL 0.07 g

葡萄糖 0.5 g

注意：A,在300-400ML水中依次溶解NaCL、KCL、MgSO4.7H2O、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、葡萄糖为A液。

B，在约50ML水中溶解CaCL2……液。

C，将B液缓缓倒入A液中，同时搅拌，……C。

D，在C液中加入1%酚红1ML，混均，加水至500ML，该液即为HaNK,S液，此液便酸。

消毒：10磅10分种高压消毒(消毒时压力波动不能大，否则葡萄糖会沉淀出来，消毒完毕须等

冷却方打开高压锅，以免液体冲出。)

保存：4度。

使用：在使用时加入 5。6% NaHCO3调PH至7·2左右，然后加入10%(体积/体积)青链霉素液。

2)5·6%NaHCO3液;

用途：调节溶液的PH值。

配制： 50ML

称量：NaHCO3 2.8g

注意：在约40ML水中溶解NaHCO3，再加水至50ML即可，NaHCO3溶解缓慢，故可适当加热

消毒：10磅10分钟高压消毒。

保存：4度。

3) 1%酚红液;

用途：作溶液的指示剂。

配制：100ML

称量：酚红 1g

注意：A)在于1N NaOH 2ML溶液中溶解酚红;酚红较为困难，所以在研钵中进行，不断研磨至溶。

B)待溶解后片刻，再加入1ML 1N NaOH

C)加水至100ML，配制完毕。

消毒：加入其它溶液中一起高压灭菌。

保存： 4度。

4) 青/链霉素原液;

浓度：1万单位青霉素、1万单位链霉素或1Mg链霉素/ML。

配制：无菌操做~K~Hp~M~2~1~0~Kp~M~2~1~0~0A~B80ML水10磅10分钟高压灭菌。

B)溶解80万单位的青链霉素于80ML水中。

分装：1～2ML小分装。

保存：-20度

使用：按1%(体积/体积)加入溶液中，终浓度100万单位青链霉素/ML

5) L-谷氨酰胺液;

浓度：30mg/ML

配制：10ML

称量：L--谷氨酰胺10ML

消毒：过滤除菌。

保存：小分装存于--20度

使用：A)用时终浓度为0.3Mg/ML

B)具体用法：M199《含血清》/L-谷氨酰胺=100ML/1ML

注意：化冻后混均。