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一株抗人内皮细胞培养及单克隆抗体的制备与鉴定方法

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摘要:
从人脐静脉分离的内皮细胞经培养后免疫Balb/c小鼠,利用小鼠杂交瘤技术,建立了一株持续分泌抗人内皮细胞单克隆抗体的杂交瘤。对其进行了较系统的鉴定,其抗体类别为IgG1。该单抗特异性地识别人内皮细胞,而与血细胞无交叉反应。
关键词:单克隆抗体,内皮细胞

前言:
血管内皮细胞具有多种生理功能,参与机体的凝血,免疫,物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动。因为血管内皮细胞损伤已成为许多疾病发生发展的基本病理过程,外周血液中内皮细胞数目的变化是血管受损的重要标志之一。本实验旨在研制一人内皮细胞的单克隆抗体,研究血管内皮细胞的生理功能,及应用于临床内皮细胞的检测。

1.材料与方法

1.1人脐静脉内皮细胞的培养
内皮细胞的培养
-)所须试剂及溶液的配制及保存。(所须水全用合格的去离子水)
1)Hank,s液
用途:用于保存标本
配制:500ml
称:Nacl 4 g KCL 0.2 g
MgSO 4 .7H 2 O 0.1 g Na 2 HPO 4 .12H 2 O 0.067 g
KH 2 PO 4 0.03 g CaCL 0.07 g
葡萄糖 0.5 g

注意:A,在300-400ML水中依次溶解NaCL、KCL、MgSO 4 .7H 2 O、Na 2 HPO 4 .12H 2 O、KH 2 PO 4 、葡萄糖为A液。
B,在约50ML水中溶解CaCL 2 ……液。
C,将B液缓缓倒入A液中,同时搅拌,……C。
D,在C液中加入1%酚红1ML,混均,加水至500ML,该液即为HaNK,S液,此液便酸。
消毒:10磅10分种高压消毒(消毒时压力波动不能大,否则葡萄糖会沉淀出来,消毒完毕须等
冷却方打开高压锅,以免液体冲出。)
保存:4度。
使用:在使用时加入 5。6% NaHCO 3 调PH至7·2左右,然后加入10%(体积/体积)青链霉素液。
2)5·6%NaHCO 3 液;
用途:调节溶液的PH值。
配制: 50ML
称量:NaHCO 3 2.8g
注意:在约40ML水中溶解NaHCO 3 ,再加水至50ML即可,NaHCO 3 溶解缓慢,故可适当加热
消毒: 10磅 10分钟高压消毒。
保存:4度。
3) 1%酚红液;
用途:作溶液的指示剂。
配制:100ML
称量:酚红 1g
注意:A)在于1N NaOH 2ML溶液中溶解酚红;酚红较为困难,所以在研钵中进行,不断研磨至溶。
B)待溶解后片刻,再加入1ML 1N NaOH
C)加水至100ML,配制完毕。
消毒:加入其它溶液中一起高压灭菌。
保存: 4度。
4) 青/链霉素原液;
浓度:1万单位青霉素、1万单位链霉素或1Mg链霉素/ML。
配制:无菌操做~0~0~0~0~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0A)80ML水 10磅 10分钟高压灭菌。
B)溶解80万单位的青链霉素于80ML水中。
分装:1~2ML小分装。
保存:-20度
使用:按1%(体积/体积)加入溶液中,终浓度100万单位青链霉素/ML
5) L-谷氨酰胺液;
浓度:30mg/ML
配制:10ML
称量:L--谷氨酰胺10ML
消毒:过滤除菌。
保存:小分装存于--20度
使用:A)用时终浓度为0.3Mg/ML
B)具体用法:M199《含血清》/L-谷氨酰胺=100ML/1ML
注意:化冻后混均。

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