通过流式细胞仪研究斑马鱼胚胎中细胞周期分析

[精华提要]结合绿色荧光蛋白表达的细胞周期分析广泛的用于研究绿色荧光蛋白标记的细胞的细胞周期分布。这个方案是一种用绿色荧光蛋白标记的斑马鱼胚胎来分析细胞周期的方法。
材料与试剂



1.        PBS（Invitrogen公司14040）

2.        胎牛血清

3.        乙醇

4.        PFA（USB）

5.        Hoechst 33342 溶液（请加目录编号）

6.        40 uM细胞过滤器（BD 352340）

7.        聚苯乙烯管流式细胞仪（BD尖底细心管352054）

8.        50ml尖底细心管中（BD 352070）



设备：



1.        流式细胞仪

2.        离心机

3.        水浴锅



步骤



1.        准备流式细胞仪分析用的胚胎

1)      在37度水浴中解冻的胎牛血清。

2)      配制PBS + 5％FBS：9.5ml 0.9x PBS + 0.5ml FBS胎牛血清。

3)      把胚胎放置在一个5ml 的聚苯乙烯流式细胞管内（每次分析50个胚胎）。尽可能多吸收液体，并添加1ml PBS / FB。

4)      用最大速度1 / 4的速度混匀胚胎。请检查没有胚胎/细胞团块。

5)      标记每个胚胎的1X 50ml 管。将40μm的细胞过滤器放到1套50ml 管。

6)      吸取胚胎的匀浆到过滤器。用1ml PBS / FB冲洗管和冲洗到过滤吸管。

7)      转移筛选后的胚胎到5ml 的聚丙烯流式细胞仪管。

8)      在2000RPM离心5分钟。

9)      吸取上清液。

如果不固定，重悬于500μl 的PBS / FB，放在冰上。

2.        甲醛固定细胞和乙醇固定/通透细胞

1)      用500μL冷0.9x PBS轻微重悬细胞。

2)      加入500μL冷的2％PFA（0.9xPBS）。轻轻混匀。

3)      冰上孵育30分钟。 （确保70％的乙醇冷冻。）

4)      4 °C离心2000RPM，5分钟。

5)      吸取上清（单独收集PFA到废物容器）和1ml 的冷0.9xPBS洗一次。

6)      4 °C 、 2000转离心5分钟。

7)      吸取上清。

Hoechst染色，直接按照Hoechst方案进行。

8)      慢慢加入1ml 70％乙醇，-20℃下细胞沉淀下降到管的底部。

9)      冰上孵育30分钟。

10)  在孵化过程中，准备PI溶液（铝箔！）

11)  4 °C离心2000转，5分钟。

12)  用500μLPI溶液重悬。

对于是固定的，没有PI，在500μL 0.9xPBS重悬浮细胞

13)  在室温暗箱中孵育30分钟。

14)  过滤40μm至50ml 细胞管内。

15)  细胞转移到5ml 的聚苯乙烯流式细胞仪管。

16)  置于冰上，然后进行流式细胞仪分析。

3.        Hoechst染色

1)      准备Hoechst 33342溶液，的1mg/ml储存液 用0.9xPBS稀释到1：1000。

2)      在28 ° C黑暗中孵育30分钟。

3)      过滤40μm到50ml 管的细胞。

4)      将5ml 的聚苯乙烯流式细胞仪管的细胞。

5)      置于冰上，然后进行流式细胞仪分析。


配方

1.  PI溶液（铝箔）：

PI + RNaseA在0.9xPBS

500ul 1mg/ml的PI储存液（20x）

100ul 10mg/ml的核糖核酸酶A股（1ul/ml）

9.4mL 0.9x的PBS
(责任编辑：大汉昆仑王)