斑马鱼胚胎DNA的制备
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材料和试剂
1. 蛋白酶K(罗氏03115836001) 2. 1M的Tris,pH值8.3 3. 氯化钾 4. 吐温20(10%,EMD4 biosciences,655207) 5. NP40(10%,Merck,492018) 设备 1. PCR仪 2. 离心机 3. 孵化器 步骤 1. 冷冻单活胚胎 1) E3洗涤dechorionated胚胎3X。 2) 将一个单个的胚胎放入一个96孔板,并移除所有多余的缓冲液。 (如果需要,干燥保存于-20°C)。 2. DNA的制备: 1) 添加50μl裂解液到单个的胚胎(活体或在situ'd)。 2) 在98 °C孵育10分钟裂解细胞。自旋向下。 3) 加入5μl蛋白酶K(10 mg / ml的储存液)到单个的胚胎。 4) 在55 °C孵育至少2个小时(长与孵育期,清除DNA) 5) 在98 °C孵育至热灭活蛋白酶K 6) 涡旋彻底和自旋出现碎片。 7) 单个胚胎的DNA 每次PCR rxn使用2μl。 配方 1. 1X PCR缓冲液: 配制50 ml: 10 mM的Tris - HCl pH值8.3(500μl 1M的Tris(pH值8.3) 50 mM氯化钾(2.5 ml的1 M氯化钾) 无菌水47 ml (可在室温下保存几个月) 2. 胚胎细胞裂解液:(含有吐温20和NP40的1X PCR缓冲液) 配制10 ml裂解缓冲液中: 1X PCR缓冲液9.4 ml 300μlNP40(10%的储存液)**现用 300μl tween20(10%的储存液),现配**~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~03. E3 60X E3的股票(2L) 34.4克氯化钠 1.52克氯化钾 5.8克CaCl2.2H2O 9.8克MgSO4.7H2O 加蒸馏水至2000 ml 储存在室温下。 饲养斑马鱼时稀释成1X,使用160 ml的储存液,并填加ddH2O至10L。 (责任编辑:大汉昆仑王) |