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斑马鱼胚胎DNA的制备

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材料和试剂



1.        蛋白酶K(罗氏03115836001)

2.        1M的Tris,pH值8.3

3.        氯化钾

4.        吐温20(10%,EMD4 biosciences,655207)

5.        NP40(10%,Merck,492018)



设备



1.        PCR仪

2.        离心机

3.        孵化器



步骤



1.        冷冻单活胚胎

1)      E3洗涤dechorionated胚胎3X。

2)      将一个单个的胚胎放入一个96孔板,并移除所有多余的缓冲液。

(如果需要,干燥保存于-20°C)。

2.        DNA的制备:

1)      添加50μl裂解液到单个的胚胎(活体或在situ'd)。

2)      在98 °C孵育10分钟裂解细胞。自旋向下。

3)      加入5μl蛋白酶K(10 mg / ml的储存液)到单个的胚胎。

4)      在55 °C孵育至少2个小时(长与孵育期,清除DNA)

5)      在98 °C孵育至热灭活蛋白酶K

6)      涡旋彻底和自旋出现碎片。

7)      单个胚胎的DNA 每次PCR rxn使用2μl。



配方



1.        1X PCR缓冲液:

配制50 ml:

10 mM的Tris - HCl pH值8.3(500μl 1M的Tris(pH值8.3)

50 mM氯化钾(2.5 ml的1 M氯化钾)

无菌水47 ml

(可在室温下保存几个月)

2.        胚胎细胞裂解液:(含有吐温20和NP40的1X PCR缓冲液)

配制10 ml裂解缓冲液中:

1X  PCR缓冲液9.4 ml

300μlNP40(10%的储存液)**现用

300μl  tween20(10%的储存液),现配**~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~03.        E3

60X E3的股票(2L)

34.4克氯化钠

1.52克氯化钾

5.8克CaCl2.2H2O

9.8克MgSO4.7H2O

加蒸馏水至2000 ml

储存在室温下。

饲养斑马鱼时稀释成1X,使用160 ml的储存液,并填加ddH2O至10L。 (责任编辑:大汉昆仑王)
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