显微注射质粒DNA技术修饰斑马鱼基因

器材：

拉针仪、显微注射器、持针器和显微操纵器、体视显微镜

试剂：

DNA 质粒样品

显微注射质粒 DNA 技术修饰斑马鱼基因的基本过程可分为如下几步：

A. 斑马鱼胚胎显微注射质粒 DNA；

B. 在显微注射后的胚胎（T0）发育到性成熟期后，与未注射过的鱼交配、待它们所产的卵发育到一定时期放在荧光显微镜下观察；

C. 如果迟至受精后 48 小时都观察不到有荧光表达的胚胎，则将这些胚胎及其显微注射过的亲本淘汰；如果发现有约 50% 的胚胎表达荧光，则将荧光阳性胚胎 (T1 代）挑出来饲养，这些胚胎的基因组中必然已整合了转基因表达载体，将荧光阴性胚胎淘汰。

D. 为获得转基因纯合体，将发育到性成熟的 T1 代个体做全同胞间交配以产生 T2 代；

E. 将 T2 代中的荧光阳性个体与野生型成年鱼一对一交配、取每对鱼产下的至少 100 个 1~2 天龄胚胎在荧光显微镜下观察，如果它们全部都表达荧光，则该 T2 个体为纯合体，将 T2 养大为成鱼以繁殖转基因纯合群体；如果某对鱼产下的胚胎中仅部分胚胎为荧光阳性．则其荧光阳性亲本为杂合体或者它从父母 (T1 代）遗传了整合位置不同的 2 个荧光转基因．我们在实际工作中将这类荧光阳性个体淘汰；

F. 鉴定出的 T2 代纯合体间的同胞交配，产生的后代将全部是转基因纯合体，由此可以使转基因纯合体得到长期保存。