非同步化细胞群体的细胞周期分析

细胞周期的动态信息可以通过标记 5＇-BrdUrd 获得，BrdUrd 可以掺入到 DNA 的胸腺嘧啶位点上。检测 DNA 中的 BrdUrd 就可以计数 S 期的细胞，如果在不同时间间隔采集标本，就可以获得细胞周期动力学的信息。

非同步化细胞群体的细胞周期分析的基本原理将细胞持续孵育在溴脱氧尿苷（BrdUrd）溶液中，在合成 DNA 的过程中，BrdUrd 可以掺入到细胞中。在 DNA 合成这间隔中，收获细胞，细胞核用双苯并咪唑，（Hoechst 33258）以及碘化物（PI）染色。在流式细胞仪上，这些染料可以被紫外光激发，从而发射蓝色和红色荧光。Br-dUrd 可以淬灭 Hoechst 染料的蓝色荧光。淬灭的程度记录了细胞经历 S 期的过程（s）；红色荧光（PI）存在于整个细胞分裂周期，通过这种方式，可以跟踪细胞周期的整个过程。

器材：

① 流式细胞仪。

② 离心机

试剂：

① 5＇-溴代-2＇-脱氧尿嘧啶核苷（BrdUrd）（Sigma，圣路易斯，密苏里州，目录号：B5002）：制成 10 mM 贮存液，冻存。

② Hoechst 33258（Sigma，目录号：B2883 或 Molecular probes，尤金，俄勒冈州，目录号：H-1398)。

③ PI（Sigma，目录号：P4170 或 Molecular probes，目录号：P-1304）：制成贮存液 100 μg/ml 于双蒸水中。

④ 染色液：100 mM Tris-HCI，pH7.4，154 mM NaCl，1 mM CaCl₂，0.5 mM MgCl₂，0.1％（v/v）Nonidet-P40，0.2％（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和 1.2 μg/ml Hoechst 33258。

非同步化细胞群体的细胞周期分析的基本过程可分为如下几步：

1 细胞分析

1.1 如果需要，用照射，加药，热击等处理细胞。

1.2 处理后，立即加适当浓度的 BrdUrd 到细胞培养液。

1.3 在固定的时间间隔（3~8 h，取决于细胞周期），收获部分细胞。

1.4 细胞离心，重悬于 500 μl 冰冷的染色液。简短涡旋混匀，冰上静置 15 min。

1.5 加 10 μl 的 PI 溶液，简短涡旋混匀，置于冰上。

1.6 上流式细胞仪分析，记录红（PI/DNA）、蓝（Hoechst/DNA）荧光。调整流速至 500 个细胞/秒。如果有可能的话，对红色荧光信号做波形分析，设门以排除任何聚集粘连的细胞核。

2 数据分析

可以通过红（PI）和蓝（Hoechst）荧光识别细胞在时间点 0 和细胞周期的 G₁ 期、S 期和 G₂/M 期等各时相。当细胞孵育在 40 μM 的 BrdUrd，细胞经历 S 期时，红色荧光增强但是蓝色荧光不变（蓝色荧光部分被 BrdUrd 淬灭）。在 BrdUrd 处理 4 h 后，在荧光图上，红色荧光在 S 期呈现轻微的弓形突出图形；在 8 h，弓形突出的程度更加明显；当然也有许多在 G₂/M 期的胞开始分裂进入 G₁ 期（未标注）；在 16 h，在 0 h 时，所有在 S 期的细胞此时都到达 G₂ 期（标记为 G₂ ＊）和少部分分裂（G₁ ＊）。一些在 0 h 时处于 G1 期的细胞现在在 S 期（Sf）；有些细胞甚至进入 G₂/M（G₂f）。到 28 h，一些在实验开始时处于 G₂ 期的细胞完成细胞周期，又回到 G₁ 期（标记为 G₁’）。