王 薇1 邵超鹏2
1 乌鲁木齐市中心血站 830000
2 深圳市血站 518020
摘要 本文重点介绍两种改良的小量DNA提取方法：快速酚－氯仿法和氯化钠(NaCl)盐析法，并分别采用新鲜全血和冰冻全血制备DNA，分析两种方法提取DNA的收获量和OD260/OD280比值,以及方法本身的难易、耗时及费用等。结果显示酚－氯仿法简便快速，全过程不到30分钟，而NaCl盐析法DNA收获率高,纯度高，且避免酚－氯仿污染。同时，我们采用序列特异性引物PCR(PCR/SSP)和反相SSO（特异的寡核苷酸序列）技术对两种方法获得的模板DNA进行HLA基因分型，结果同一份标本采用快速酚－氯仿法和氯化钠盐析法制备的DNA模板HLA基因型别一致。我们推荐快速酚－氯仿法可用于紧急或特殊情况下的DNA提取,而氯化钠盐析法适合临床常规DNA分离。
关键词 DNA提取法 HLA 基因分型
Rapid DNA extraction from whole blood and its application in HLA genotyping
This article introduced two improved small quantitative DNA extraction:&127;rapid phenol/chloroform method and&127;sodium chloride ( NaCl )salting out method. The DNAs, prepared from fresh whole blood and frozen whole blood through two ways respectively, were analyzed in their quantity and OD260/OD280 ratio. The difficulty, time and cost&127;of two methods were compared. The results showed that the phenol/chloroform extraction was simple and rapid, which was porformed in an overall time of no more than 30 minutes; however, the improved NaCl salting out technique can isolate more quantitative and purer DNA, and have no pollution of
Rapid DNA extraction from whole blood and its application in HLA genotyping
Wang Wei，Shao Chaopeng. Wulumuqi Blood Center, Xinjiang, 830000 Shenzhen Blood Center, Shenzhen, 518020
Abstract
phenol/chloroform. Its showed the HLA genotypes of DNAs, extracted from the same sample by using rapid phenol/chloroform extration and sodium chloride ( NaCl )salting out method, were completely same. We conclude that the rapid phenol/chloroform extraction is feasible in urgent or special condition, and the improved NaCl salting out method is suitable for routine clinical DNA isolation.
Key words DNA extraction HLA Genotyping
真核细胞高分子量DNA提取的质量好坏是影响后续试验的重要因素，尤其在HLA基因分型中，模板DNA的质量是分型结果准确性的重要保证，制备速度的快慢亦为多数实验室考虑的主要因素之一。目前主要采用标准酚－氯仿法。本文采用经改良调整的酚－氯仿法和氯化钠盐析法，分别进行新鲜全血和冻存全血的DNA制备，获得满意结果。实验者可以根据临床需要及实验时间安排(全血-70℃可长期保存[1])选择合适的方法，现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 GDS8000凝胶成像分析仪，Gene Company; RNA/DNA测定仪，Pharmacia；pHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂；9600基因扩增仪，Perkin Elmer。
1.1.2 主要试剂 蛋白酶K，E Merk；Triton X-100，Nacalai Tesque；Tris，Serva；琼脂糖，Serva；Taq DNA聚合酶，Promega；dNTP，Promega。
1.1.3 PCR/SSP引物 德国Essen大学医学院，由同济医科大学医学免疫学研究室龚非力教授赠送。
1.1.4 反相SSO HLA分型试剂盒 INNO-LIPA。
1.2 实验方法
1.2.1 快速酚－氯仿法
将新鲜抗凝全血或冻存抗凝全血0.5～1ml置于1.5ml Beckman离心管中,补满细胞裂解缓冲液(0.32mol/L蔗糖; 1% Triton X-100; 0.005mol/L MgCl2·6H2O; 0.012 mol/L Tris-HCl pH7.5）, 混合，15000rpm离心3min，去上清，重复裂解1次后，用无菌双蒸水洗涤沉淀1次，倾去上清，吸干管口，用80μl DNA稀释缓冲液(0.375 mol/L NaCl; 0.12 mol/L EDTA)将沉淀轻轻混匀，再加15μl 20% SDS, 100μl 5 mol/L NaCl,用手摇匀30秒，加240μl无菌双蒸水，并立即加入350μl 酚－氯仿混合液充分混合30秒，12000rpm离心3min，小心将水相转至另1支Beckman管中，加860μl无水乙醇颠倒摇动数次至DNA絮状析出，挑出DNA，加860μl 70%乙醇混合去盐，12000rpm离心3min，去上清吸干管口, 37℃干燥10min，加100μl无菌双蒸水溶解DNA。于RNA/DNA测定仪进行DNA测定分析。
1.2.2 NaCl盐析法
新鲜抗凝全血或冻存抗凝全血2～3ml置于25ml Beckman离心管中,补3倍体积的红细胞裂解液(0.01mol/L Tris-HCL pH7.6; 0.01mol/L NaCl; 0.005mol/L MgCl2)混合，2500 rpm离心15 min，移去上清留约1ml，再用同体积的红细胞裂解液两次裂解红细胞，沉淀用生理盐水洗涤1次，收集白细胞沉淀，并转至1.5ml Beckman离心管中。沉淀中加入150μl TE混匀，再加15μl 10% SDS, 及蛋白酶K至终浓度0.5mg/ml，56 ℃消化过夜, 得到清亮粘绸的液体。加入235μl 5 mol/L NaCl，轻轻摇匀至少1min，5000 rpm离心10 min，将上清转至另一支1.5ml Beckman离心管中，同快速酚－氯仿法用无水乙醇析出DNA，70%乙醇去盐，最后溶于100μl无菌双蒸水中, 进行测定分析。 (责任编辑：大汉昆仑王)
