克隆基因的表达

 

　　使克隆的基因在细胞中表达对理论的研究和实验的应用都是十分重要的意义的。克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上、以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的 载体 中，这种 载体 就称为表达 载体 （expression vector）。克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表达，可用大肠杆菌、枯草杆菌、 酵母 、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞、以至整体动物。对不同的表达系统，需要构建不同的表达载体。克隆基因在不同的系统中表达成功的把握性，取决于我们对这些系统中基因表达调控规律的认识程度。

图20-11　几种常用的大肠杆菌表达载体

人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点；此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。图20-12中绘出几种常用的表达载体例子。pBV220是我国科学工用者自己构建的表达载体，使用了很强的PRPL双启动子，含有编码温度敏感性阻遏蛋白的cI857基因，在30-32℃时产生的阻遏蛋白能阻止PRPL的转录起始，细菌可以正常生长繁殖，42摄氏度时该阻遏蛋白发生构像变化而失活，基因开始转录而表达。

图20-12　真核表达载体pSV2-neo

　　当要将真核基因放入原核细胞中表达产生蛋白质时，原核系统就表现出许多缺陷：①没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的 基因组 基因；②没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；③表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusiion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成快速太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性（renaturation），使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。

　　要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越，常用的 酵母 、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。真核表达载体至少要含两类序列：①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。图20-12举出一个真核表达载体的例子。