请问质粒插入序列后会影响GFP的表达吗？

我有自己构建的带GFP标签的空载质粒，转染后镜下观察荧光有强有弱大概占60-70%左右，流式检测有40%；然后在该质粒GFP前插入目的基因（目的基因后带T2A帮助GFP表达），一个目的基因插入后对GFP荧光影响不大，但另外一个基因插入后只有0.1%的细胞有荧光而且还很弱。有两个问题：

1. 空载质粒检测荧光占比也没那么高的原因会是转染后培养时间长细胞增殖，但增殖细胞没有荧光导致的荧光占比低吗？或是转染上有什么其他可调整的能帮助提升转染效率吗？

2. 为什么在目的蛋白插入后同样情况下有的会影响GFP的表达？目的蛋白的表达会有影响吗（我还没检测过）？有什么方法可以改进吗？

谢谢