拟南芥定位克隆中的几个问题

在过去十多年里，拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）遗传学在植物 生物 化学、生理学、病理学和发育 生物 学研究中发挥着越来越重要的作用。许多研究者想知道某种性状是由那个基因改变产生的。如果突变是由T-DNA或转座子插入引起，插入序列会提供一个直接指向基因的标签。但是绝大多数遗传变异不属于这种情形。由于多种原因，化学诱变剂和辐射广泛用于诱导突变，以EMS为例，它比其他诱变剂更简单易行、效率更高，且能引起单碱基对替换，更有可能产生诸如弱的、显性的或条件等位基因等特殊性质突变。除此之外，还有大量的自然突变，并可能反映其DNA序列的微小变化。在上述情形之下，除定位克隆（positional cloning）外，另无它法选择。但定位克隆一直被认为是一种耗时、费钱的过程。基因组测序计划的完成使这种情况发生极大变化，以前染色体步移（chromosome walking）认为是最单调辛苦、技术难度大的过程，现在也已不再如此。利用已知的序列信息可极大地提高分子绘图的效率；几乎可用一些分子生物学常规方法，就可在几个月内分离任何突变基因。

一、作图精度（mapping resolution）

与基因标签法（gene tagging）相反，图位克隆（map-based cloning）或定位克隆（positional cloning）本质上是一种间接克隆基因的手段。通过渐进排除基因组的其他无关部分，来逐步缩小（narrow down）包含突变基因的染色体或DNA片段。一旦明确了包含突变基因的染色体或DNA片段，就可用其他手段来找出这个区域的那个基因发生了突变。显然包含突变基因的染色体或DNA片段间距越小，作图精度越高，基因克隆就越容易。

在拟南芥上，1%的重组率对应的遗传距离平均相当于250 kb的物理距离。但遗传距离与物理距离的比率并不稳定，随基因所在染色体的位置及不同作图群体而异。

作图精度主要取决于作图群体的大小。在约1000株拟南芥（约2000个染色体）的作图群体中常规可达到10-40 kb的作图精度。这样长的典型的DNA片段包含2-10个基因。

如果包含突变基因的染色体或DNA片段足够短，这个片段的注释在大多数情况下就可提供足够的信息来选择候选基因并确定突变等位基因的DNA序列。另外，也可用分子互补（molecular complementation）的方法，通过将野生型DNA的重叠片段转化到突变体中去，以确定那个序列可将突变体恢复到野生型。这种方法对隐性突变体是相当直接的方法，但对于显性或半显性遗传的获得功能突变体（gain-of-function mutant）却存在问题。后者可将显性突变体等位基因转移到野生型，来产生突变体表型以确定。通常是通过与突变体等位基因相关的RFLP来加以鉴定。也可通过扫描完整DNA片段内由酶解或化学裂解错配碱基（enzymatic or chemical cleavage of mismatched bases）、分析单链构象多态性（single-strand conformational polymorphism，SSCP）、异源双链分析（heteroduplex analysis）或变性HPLC等产生的变异。

二、分子作图的资源与手段

高精度作图需要高密度的遗传标记。若干拟南芥品系（accession）或生态型（ecotype）足以用来设计高密度分子标记。收集T-DNA系的Wassilewskija（Ws）及收集有多样不同种系的Niederzenz已成功地用于定位克隆项目。

用于作图最常用的组合是Landsberg erecta × Cloumbia（Ler × Col），这两个品系估计每1000 kb内在4-11个位置存在差异。在Ler × Col作图群体方面已经积累了许多宝贵的资源。对Cloumbia品系的基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative，2000）。在拟南芥种质资源中心（Arabidopsis stock center）贮存有包括基因组的和cDNA噬菌体文库、BAC文库、YAC文库，及用于分子互补的可转化人工染色体（transformation-competent artificial chromosomes）文库等。Landsberg erecta品系的序列信息有利于设计新的分子标记。在Cloumbia或Landsberg erecta品系中已诱导出的绝大多数突变（包括表型可见的突变）也可用作分子标记。Landsberg erecta × Cloumbia杂交已经产生重组体近亲系（recombinant-inbred line），并用来确定约1200个分子标记，其中超过80个分子标记是基于PCR的。

目前广泛用于作图实验的分子标记是简单序列长度多态性（SSLPs）、酶切扩增多态性序列（CAPS）及衍生型CAPS（dCAPS）。这些标记有两个共同特征：①它们都是共显性的，这意味着植株的两套染色体都可分型，并能从作图群体中的搜集最大量的信息；②它们都是以PCR为基础的，并且可在 琼脂 糖凝胶上分析，这使得这些方法简单易行，且价格便宜。