材料与仪器
HEPES-KOH 山梨醇 抗坏血酸维生素 C 半胱氨酸 PF-Percoll
浓缩离心设备
浓缩离心设备
步骤
建议在短日照条件下培养材料以诱导营养生长，并在照光的早期收取材料以提高获得完整叶绿体的产率。所以试剂应在收集材料之前准备好，并连同其他一些设备，如离心机转头及离心管等在冰箱或冰上冷却至 0~4°C。为避免叶绿体过多地暴露于光下或破碎，所有操作应尽可能在绿光下迅速完成。整个分离过程 30~40 min 可以完成。
( 1 ) 在 10 h 光照（23°C ) / 14 h 黑暗（17°C ) 光周期条件下培养拟南芥材料 5~6 周，开花前收取叶片。
( 2 ) 配制所有溶液，并连同所有设备（包括离心机以及转头）一起冷却至 0~4°C。
( 3 ) 剪取植物叶片（见注释 2) ，并用蒸馏水清洗以确保没有土壤附着。
( 4 ) 按每 10 g 材料加 100 ml 匀浆缓冲液（介质 A ) 的比例将材料和预冷的缓冲液混和在带有利刃的搅拌机中研磨 3 次，每次 10s。
( 5 ) 匀浆液用双层尼龙布过滤（22 μm，见注释 3) 。
( 6 ) 滤液在 1300 g 离心力下离心 3 min，沉淀即为叶绿体粗提物。
( 7 ) 将叶绿体粗提物重新悬浮在尽可能小体积的介质 B 中（轻轻搅动液体让沉淀悬浮）。将悬浮的粗提物置于 Percoll 非连续梯度（40%~85%，见注释 4 ) 表面，用 swing-out (非固定转角）转头在 3750 g 离心力下离心 10 min。
( 8 ) 用尖头吸管从 40% 与 85% Percoll 的界面处收集完整的叶绿体，加入介质 B 以稀释 Percoll，直至叶绿素浓度为 1~3 mg/ml ( 见注释 5) 。然后在 1200 g 的离心力下离心 3 min，所得沉淀即为完整的叶绿体。
( 9 ) 要继续分离类囊体和基质蛋白，则加入裂解液轻轻地悬浮叶绿体沉淀，至叶绿素浓度为 1~3 mg/ml。悬浮液置于冰上 5~10 min，让叶绿体吸水膨胀并最终破裂释放出基质蛋白。也可以用微量研磨器对样品轻轻地稍加匀浆以更好地破碎叶绿体，注意研磨不能用力，以免破坏类囊体。
( 10 ) 10000 g 离心力下离心 20 min，所得上清液即为基质蛋白抽提物，沉淀即为类囊体。为更好地去除污染，上清液需要在 300000 g 的离心力下继续离心 25 min (参见注释 6)。
( 11 ) 用含有 3kDa 过滤器的离心浓缩器浓缩基质蛋白。裂解液中各种盐离子浓度均比较低，与各种样品缓冲液（如等电聚焦缓冲液、SDS 缓冲液、蓝绿或无色非变性胶缓冲液以及用于蛋白酶解的缓冲液）均能兼容。
( 12 ) 类囊体部分重新悬浮在相同的裂解液中，并进行色素和蛋白质定量。后续的蛋白质组分析需要用有机溶剂（如 70% 丙酮）或离子（SDS) 与非离子（OGG、DM ) 变性剂去除其中所含的色素（叶绿素和胡萝卜素）以及脂溶性分子（如质体醌）。最近的一些有关叶绿体膜蛋白组的分析可以参考文献 [7, 8, 10, 11 ，18, 19]。
( 1 ) 在 10 h 光照（23°C ) / 14 h 黑暗（17°C ) 光周期条件下培养拟南芥材料 5~6 周，开花前收取叶片。
( 2 ) 配制所有溶液，并连同所有设备（包括离心机以及转头）一起冷却至 0~4°C。
( 3 ) 剪取植物叶片（见注释 2) ，并用蒸馏水清洗以确保没有土壤附着。
( 4 ) 按每 10 g 材料加 100 ml 匀浆缓冲液（介质 A ) 的比例将材料和预冷的缓冲液混和在带有利刃的搅拌机中研磨 3 次，每次 10s。
( 5 ) 匀浆液用双层尼龙布过滤（22 μm，见注释 3) 。
( 6 ) 滤液在 1300 g 离心力下离心 3 min，沉淀即为叶绿体粗提物。
( 7 ) 将叶绿体粗提物重新悬浮在尽可能小体积的介质 B 中（轻轻搅动液体让沉淀悬浮）。将悬浮的粗提物置于 Percoll 非连续梯度（40%~85%，见注释 4 ) 表面，用 swing-out (非固定转角）转头在 3750 g 离心力下离心 10 min。
( 8 ) 用尖头吸管从 40% 与 85% Percoll 的界面处收集完整的叶绿体，加入介质 B 以稀释 Percoll，直至叶绿素浓度为 1~3 mg/ml ( 见注释 5) 。然后在 1200 g 的离心力下离心 3 min，所得沉淀即为完整的叶绿体。
( 9 ) 要继续分离类囊体和基质蛋白，则加入裂解液轻轻地悬浮叶绿体沉淀，至叶绿素浓度为 1~3 mg/ml。悬浮液置于冰上 5~10 min，让叶绿体吸水膨胀并最终破裂释放出基质蛋白。也可以用微量研磨器对样品轻轻地稍加匀浆以更好地破碎叶绿体，注意研磨不能用力，以免破坏类囊体。
( 10 ) 10000 g 离心力下离心 20 min，所得上清液即为基质蛋白抽提物，沉淀即为类囊体。为更好地去除污染，上清液需要在 300000 g 的离心力下继续离心 25 min (参见注释 6)。
( 11 ) 用含有 3kDa 过滤器的离心浓缩器浓缩基质蛋白。裂解液中各种盐离子浓度均比较低，与各种样品缓冲液（如等电聚焦缓冲液、SDS 缓冲液、蓝绿或无色非变性胶缓冲液以及用于蛋白酶解的缓冲液）均能兼容。
( 12 ) 类囊体部分重新悬浮在相同的裂解液中，并进行色素和蛋白质定量。后续的蛋白质组分析需要用有机溶剂（如 70% 丙酮）或离子（SDS) 与非离子（OGG、DM ) 变性剂去除其中所含的色素（叶绿素和胡萝卜素）以及脂溶性分子（如质体醌）。最近的一些有关叶绿体膜蛋白组的分析可以参考文献 [7, 8, 10, 11 ，18, 19]。
来源：丁香实验
