小鼠细胞染色体制片与观察
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一、目的
学习小鼠骨髓细胞及外周血细胞染色体的制片方法，观察小鼠端着丝点染色体的形态。
二、原理及说明
染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。
小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。利用骨髓的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。另外，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。主要的中期相来自成红细胞系统，也来自各种骨髓母细胞，单核细胞和淋巴细胞的分裂相是较少的。不过，在染色体制片上已无法区别上述来源。多倍体的中期相（4n、8n和16n）往往来自于巨核细胞。
对大型动物通常采用对骼骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到的染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。
不过，在有些情况下，穿刺取骨髓较困难，或者希望对同一个体材料进行连续的对比取材，以观察药物或环境因素对人类或动物的影响及染色体的动态变化。这时，采用外周血细胞而不伤害供血者直接制备染色体的技术就十分有利了。
因此，本实验以小鼠为材料，介绍两种方法：①直接制片法，即直接取骨髓细胞经空气干燥法进行制片；②小鼠外周血细胞快速染色体制片法。为提高有丝分裂指数，在动物实验时，可在取材前经腹腔注射秋水仙素。
三、实验材料
两个月龄的健康小鼠。
四、器具和 试剂
解剖器具（剪刀、镊子、解剖刀）、2ml注射器、5号针头、10ml刻度 离心管 、吸管、试管、载玻片、离心机、显微镜、水浴锅。
肝素溶液：国产肝素每mg约含154个国际单位（iu），用0.85％NaCl配制成500iu/ml的肝素溶液，69kPa（10磅/ 2 ）灭菌20分钟。
秋水仙素（0.01％）、柠檬酸钠溶液（2％）、0.05～0.06mol/LKCl、0.075mol/L KCl、甲醇、冰醋酸、磷酸缓冲液（pH6.8），Giemsa原液。
五、实验步骤
（一）小鼠外周血染色体快速制片法
1．取成年健康小鼠，每只腹腔注射0.01％秋水仙素0.3～0.4ml。
2．3～4小时后，用预先经肝素浸湿过的洁净注射器心脏采血0.5ml，移入 离心管 （适量加肝素抗凝）。
3．然后加入经37℃预温的0.05～0.06mol/L KCl溶液至8ml混匀后，置37℃ 水浴 中低渗处理20分钟左右。
4．加入1ml新配制的甲醇-冰醋酸3∶1的固定液，待充分混匀后700～800rpm离心5分钟，弃去上清液，留沉淀约0.5ml。
5．滴加甲醇-冰醋酸（3∶1）固定液4.5ml，轻轻混匀，固定30分钟。
6．1200～1500rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀约0.5ml。
7．重复固定约20分钟，离心后留0.2ml沉淀物。
8．用吸管反复轻吸混匀，制成细胞悬液。
9．取洁净冰水中预冷的载玻片，稍作倾斜，用吸管吸取一滴上述细胞悬液，于载玻片上适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀载玻片上细胞，空气中自然干燥（所得制片可留作显带实验）。
10．载玻片充分干燥后，用pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液9份磷酸缓冲液混匀后染色。材料面向上，用染液覆盖载玻片，染色10～15分钟，用流水洗去多余染液，再用吸水纸吸干多余水分，干燥后即可镜检。
（二）小鼠骨髓细胞染色体制片法
1．取上述经心脏采血的小鼠，以脱颈椎法处死，立即用剪刀剪去大腿处的皮肤和肌肉，连同关节头一起取下两侧股骨和胫骨，剔净其上肌肉，用2％柠檬酸钠溶液洗净。剪去关节头，使其露出骨髓腔，用吸有适量2％柠檬酸钠溶液的注射器，将针头插入骨髓腔，将骨髓用柠檬酸钠溶液吹洗入刻度 离心管 ，反复吹洗直至骨腔变白。
2．将所得的骨髓细胞悬液1000rpm离心10分钟，吸去上清液，加 0.075mol/L KCl5～8ml，立即用 吸管 吹打均匀，室温下静置低渗25分钟。
3．低渗后立即1000rpm离心10分钟，去上清，沿管壁加 5～8ml甲醇-冰醋酸（3∶1）固定液，立即吹散打匀，静置30分钟。重复一次固定，第三次改用甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液再固定20分钟，然后离心去上清，留约0.1～0.2ml的沉淀细胞和上清液，视细胞多少可再加甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液2～3滴，摇匀制成细胞悬液。
4．制片：方法如（一）中步骤9和10。染色亦可在载玻片上用醋酸洋红染色数分钟即可。
六、实验结果及思考题
1．在低倍及中倍镜下观察Giemsa染色之后的染色体制片，寻找适当的中期相，并比较两种制片法的制片效果。
2．找出分散适度的中期染色体图象，在油镜下进行仔细观察，熟悉小鼠染色体的形态，统计2n的染色体数目。
3．KCl溶液低渗处理与滴片过程在染色体制片中有何联系，对制片结果各有何影响？
学习小鼠骨髓细胞及外周血细胞染色体的制片方法，观察小鼠端着丝点染色体的形态。
二、原理及说明
染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。
小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。利用骨髓的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。另外，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。主要的中期相来自成红细胞系统，也来自各种骨髓母细胞，单核细胞和淋巴细胞的分裂相是较少的。不过，在染色体制片上已无法区别上述来源。多倍体的中期相（4n、8n和16n）往往来自于巨核细胞。
对大型动物通常采用对骼骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到的染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。
不过，在有些情况下，穿刺取骨髓较困难，或者希望对同一个体材料进行连续的对比取材，以观察药物或环境因素对人类或动物的影响及染色体的动态变化。这时，采用外周血细胞而不伤害供血者直接制备染色体的技术就十分有利了。
因此，本实验以小鼠为材料，介绍两种方法：①直接制片法，即直接取骨髓细胞经空气干燥法进行制片；②小鼠外周血细胞快速染色体制片法。为提高有丝分裂指数，在动物实验时，可在取材前经腹腔注射秋水仙素。
三、实验材料
两个月龄的健康小鼠。
四、器具和 试剂
解剖器具（剪刀、镊子、解剖刀）、2ml注射器、5号针头、10ml刻度 离心管 、吸管、试管、载玻片、离心机、显微镜、水浴锅。
肝素溶液：国产肝素每mg约含154个国际单位（iu），用0.85％NaCl配制成500iu/ml的肝素溶液，69kPa（10磅/ 2 ）灭菌20分钟。
秋水仙素（0.01％）、柠檬酸钠溶液（2％）、0.05～0.06mol/LKCl、0.075mol/L KCl、甲醇、冰醋酸、磷酸缓冲液（pH6.8），Giemsa原液。
五、实验步骤
（一）小鼠外周血染色体快速制片法
1．取成年健康小鼠，每只腹腔注射0.01％秋水仙素0.3～0.4ml。
2．3～4小时后，用预先经肝素浸湿过的洁净注射器心脏采血0.5ml，移入 离心管 （适量加肝素抗凝）。
3．然后加入经37℃预温的0.05～0.06mol/L KCl溶液至8ml混匀后，置37℃ 水浴 中低渗处理20分钟左右。
4．加入1ml新配制的甲醇-冰醋酸3∶1的固定液，待充分混匀后700～800rpm离心5分钟，弃去上清液，留沉淀约0.5ml。
5．滴加甲醇-冰醋酸（3∶1）固定液4.5ml，轻轻混匀，固定30分钟。
6．1200～1500rpm离心10分钟，弃上清液，留沉淀约0.5ml。
7．重复固定约20分钟，离心后留0.2ml沉淀物。
8．用吸管反复轻吸混匀，制成细胞悬液。
9．取洁净冰水中预冷的载玻片，稍作倾斜，用吸管吸取一滴上述细胞悬液，于载玻片上适当高度滴在载玻片上，立即吹散吹匀载玻片上细胞，空气中自然干燥（所得制片可留作显带实验）。
10．载玻片充分干燥后，用pH6.8的磷酸缓冲液按1份Giemsa原液9份磷酸缓冲液混匀后染色。材料面向上，用染液覆盖载玻片，染色10～15分钟，用流水洗去多余染液，再用吸水纸吸干多余水分，干燥后即可镜检。
（二）小鼠骨髓细胞染色体制片法
1．取上述经心脏采血的小鼠，以脱颈椎法处死，立即用剪刀剪去大腿处的皮肤和肌肉，连同关节头一起取下两侧股骨和胫骨，剔净其上肌肉，用2％柠檬酸钠溶液洗净。剪去关节头，使其露出骨髓腔，用吸有适量2％柠檬酸钠溶液的注射器，将针头插入骨髓腔，将骨髓用柠檬酸钠溶液吹洗入刻度 离心管 ，反复吹洗直至骨腔变白。
2．将所得的骨髓细胞悬液1000rpm离心10分钟，吸去上清液，加 0.075mol/L KCl5～8ml，立即用 吸管 吹打均匀，室温下静置低渗25分钟。
3．低渗后立即1000rpm离心10分钟，去上清，沿管壁加 5～8ml甲醇-冰醋酸（3∶1）固定液，立即吹散打匀，静置30分钟。重复一次固定，第三次改用甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液再固定20分钟，然后离心去上清，留约0.1～0.2ml的沉淀细胞和上清液，视细胞多少可再加甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液2～3滴，摇匀制成细胞悬液。
4．制片：方法如（一）中步骤9和10。染色亦可在载玻片上用醋酸洋红染色数分钟即可。
六、实验结果及思考题
1．在低倍及中倍镜下观察Giemsa染色之后的染色体制片，寻找适当的中期相，并比较两种制片法的制片效果。
2．找出分散适度的中期染色体图象，在油镜下进行仔细观察，熟悉小鼠染色体的形态，统计2n的染色体数目。
3．KCl溶液低渗处理与滴片过程在染色体制片中有何联系，对制片结果各有何影响？
