细菌菌落制片

1. 观察圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验一菌落特征描述的方法记录结果。

2. 血液琼脂培养基的制备：

（1）成分pH7.6肉膏蛋白胨琼脂培养基10 ml，无菌脱纤维羊血（或兔血）1 ml。

（2）将肉膏蛋白胨琼脂培养基加热溶化。

（3）待冷至45℃时，以无菌操作加1 ml 无菌脱纤维羊血于培养基内，立即摇荡使血液和琼脂培养基充分混匀。

（4）迅速以无菌操作倒入平板，使成血液琼脂平板，注意不要产生气泡。

（5）置37℃过夜，如无菌生长即可使用。

（6）将无菌的平板取出进行划线接种分离单个菌落，因要保持琼脂表面完整，接种改用圆头光滑玻棒，注意不要把琼脂划破。接种后，倒置于37℃温室中培养，次日观察结果。如有单独菌落出现，即可进行下项实验。

3. 细菌菌落制片

（1）细菌菌落印取选择一个较小的单独菌落，用小刀将菌落周围约10~15 mm 的正方琼脂切下，将此琼脂块上长有菌落的一面朝下，轻放在盖玻片上，然后连同琼脂块将盖玻片小心放于Bouin氏固定液中约1小时，直至琼脂完全变为白色后取出，将琼脂小心剥去，剥时注意勿损伤菌落，仅使菌落留下，附着在盖玻片上。

（2）用细水流轻轻冲洗附有菌落的盖玻片。

（3）用0.01%结晶紫染液染色3分钟后水洗，吸干。

（4）脱水将盖玻片置于由低浓度到高浓度的酒精中（35%、50%、60%、70%、80%、95%、100%）各5分钟，但在100%酒精中浸15分钟。

（5）透明取出经过脱水的盖玻片，再放入二甲苯中2分钟。

（6）封固从二甲苯中取出盖玻片，用软纸拭去菌落周围的二甲苯。随即加一小滴加拿大乳胶于一洁净载玻片的中央，迅速反转盖玻片，轻轻地放在载玻片上，使加拿大乳胶铺满盖玻片，注意不要产生气泡，如果有气泡即轻轻压出。用低倍显微镜观察其菌落特征。待乳胶完全干燥，一二天后装木匣内保存。

4. 结果

将观察到的微生物菌落特征填入下表中。