血红蛋白的测定

[实验目的]
　　掌握用直接测定法和比色法测定动物的血红蛋白的含量。
[实验原理]
　　血红蛋白的颜色常与氧的结合量多少有关。但当用一定的氧化剂将其氧化时，可使其转变为稳定、棕色的高铁血红蛋白，而且颜色与血红蛋白（或高铁血红蛋白）的浓度成正比。可与标准色进行对比，求出血红蛋白的浓度，即每升血液中含血红蛋白克数（g·L-1）。
　　血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定的氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide,HiCN）。HiCN在波长540 nm和液层厚度1cm的条件下具有一定毫摩尔消光系数。可用经校准的高精度分光光度计进行直接定量测定；或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。
[实验对象]
　　动物种类不限。
[实验药品]
　　 HiCN转化液（Van Kampen-Zijlstra液，文齐氏液※，标准商品）或1%HCl、HiCN标准液（200 g·L ^- 1，标准商品）、蒸镏水、95%酒精、乙醚、75%酒精.
[ 仪器 与器械]
　　血红蛋白计（或分光光度计）或沙里氏血红蛋白计、小试管、刺血针或注射器，微量采血管，干棉球。
[实验方法与步骤]
　　1.使用血红蛋白计直接定量测定
　　（1）XK-2血红蛋白仪板面结构如图 (6.2-1)：

　　（2） 仪器 的标定
　　①板面后的电源开关置于断。仪器的底部的支撑架打开。
　　②打开电源开关，选择键处于测试挡。
　　③按一下进样键，将蒸溜水吸入，预热30 min
　　④预热后将文齐 试剂 吸入，仔细调“调零旋钮”使显示屏上的数字显示为零。
　　⑤校正：吸入标准液(仪器配带有)后，缓缓旋转校正旋钮使显示屏上数字显示为已知的标准液的数值。定标即结束。以后调零和校正旋钮均不能动。
　　（3）在小试管中事先加入HiCN转化液(文齐氏液)5 ml。
　　（4）取血：可吸取从动物的指（尾）端流出的第二滴血，也可取静脉血和心脏血。用拇指和食指轻轻捏扁采血管的乳胶头，将采血管的一端水平接触血滴（若是抗凝血，须注意摇匀后再吸取），轻轻缓慢地松开拇指，利用虹吸现象使血液进入微量采血管至20 μl（第2个刻度）。用棉球擦去微量采血管尖端外周的血液。
　　（5）血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白：将微量采血管插入小试管HiCN转化液中，置血液于管底，再吸上清液2～3次，洗尽采血管内的残存的血液。用玻棒轻轻搅动管内血液，使之与HiCN转化液混匀。试管须静止5 min。
　　(6)将混合后的血液吸入血红蛋白仪，显示屏上的数字即为测定值，需稳定后方可读数(g·L ^-1 )。
　　2.使用HiCN标准液比色法测定
　　（1）标准曲线绘制和K值计算：将标准HiCN液按梯度50 g·L ^-1 、100 g·L ^-1 、150 g·L ^-1 、200 g·L ^-1 进行稀释后（以此代表标准的血红蛋白浓度梯度），在波长540 nm、光径1.0cm条件下，分别测定各稀释液的吸光度(例如分别测得0.13、0.27、0.405、0.54)，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出换算常数K。