四环素的定向发酵

一、目的和要求
　　1、通过实验加深对定向发酵的理解。
　　2、学习利用沉淀或溶媒法提取四环类抗生素的操作技术。

二、原理
　　金霉素在化学结构上与四环素十分相似，区别仅在C-7位上，以Cl取代了H。所以，金霉素又称为7-氯四环素。金霉素链霉菌是金霉素的产生菌，但当培养基中存在抑氯物质时，由于氯的掺入受阻，而使得金霉素链霉菌的生物合成方向发生变化，并使四环素成为主要产物。
　　本实验以M-促进剂（硫醇苯骈噻唑）作为氯化霉的抑制剂，以溴化钠作为竞争性抑制剂进行四环素的定向发酵。四环素是两性化合物，通常可以采用沉淀法、溶媒萃取法或离子交换法进行提取。本实验采用了前2种方法，它们的分离主要是利用了四环素既可以与酸、碱反应，同时又可以与某些金属离子形成盐类，及其在不同溶剂、不同pH值时溶解度不同的特性，进行反复萃取，最后通过精制结晶和洗涤而获得成品。

三、实验材料
　　1、菌种：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）
　　2、培养基：斜面菌种用麦仁培养基，300ml三角瓶中分装25ml四环素种子培养基，500ml三角瓶中分装50ml发酵培养基，共4种。
　　3、四环素发酵液（发酵液效价≥10,000u/ml）。
　　4、化学 试剂 ：草酸，EDTA混合 试剂 ，2mol/L HCl，黄血盐，ZnSO ₄ ，2mol/L HCl，11% HCl，20% HCl，MgCl ₂ ，CaCl ₂ ，20%乙醇溶液，氨水，Na ₂ CO ₃ /NaOH
　　（1：1）混合碱，20% NaOH，pH分别为2、4.5的酸水，4% HCl/正丁醇（1：10），丙酮。
　　5、灭菌物品：10ml破口吸管。
　　6、其它：接种用具，50ml、100ml、500ml三角瓶，50ml、100ml、500ml烧杯，滴管，50ml容量瓶，100ml量筒，50ml 离心管 ，玻璃漏斗，滤纸，玻璃棒，精密pH试纸， 水浴 锅，摇床，剪刀，天平，布氏漏斗，结晶皿，称量瓶，药勺， 真空泵 ，抽滤

四、实验实施
　　1、制备斜面孢子：将活化的金霉素链霉菌接入麦仁培养基斜面，35～37℃培养5天。
　　2、制备种子：将约1cm2的麦仁孢子接入25ml四环素种子培养基中，200r/min、28℃下振荡培养20h，扩繁1次。
　　3、发酵：以破口 吸管 取2.5ml种子液接入50ml发酵培养基中，200r/min、28℃下振荡培养5天。
　　4、四环素的沉淀提取