发酵法

在无氧条件下，酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO₂的作用，称为乙醇发酵。目前乙醇发酵所采用的微生物主要是酵母菌。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种，由于起酵母数量太少，不够生产之需，所以必须将斜面菌种进行若干次的扩大培养，以获得含有足够数量酵母菌的酵母培养物（通常是液体培养物，也有固体培养物的），以供乙醇发酵以用，故被称为酒母。

 

一、酵母菌的扩大培养

1.  培养基的制备

酵母扩大培养中的试管和三角瓶培养用的基通常采用麦牙汁，其制备方法如下：将干麦牙磨碎，加入3.5倍量的65 ℃的热水，在58～60 ℃的温度下糖化3～4 h，以碘液检查糖化完全后，将其煮沸、过滤，将滤液浓度调整到13^oBx。将上述制备好的麦牙汁进行分装并灭菌。

（1）固体斜面使馆培养基：取100 ML麦牙汁，加入2 %琼脂，融化后分装试管，一般培养基的装量是试管容量的1/5。以121 ℃蒸汽灭菌20min，取出后趁热置成斜面，放冷，斜面的长度为试管长度的1/2～3/5。

（2）液体试管培养基：用稀硫酸将麦牙汁pH调节至4～4.4，分装于试管中，每支试管分装5 ML。以121 ^oC蒸汽灭菌20 min。

（3）小三角瓶培养基：将pH调节至4～4.4的麦牙汁分装于容量为150ML的三角瓶中，每瓶装50ML，以131^oC蒸汽灭菌20 min。

2.  接种与扩大培养

（1）将斜面试管酵母原菌移接于固体斜面试管，于28～30 ℃下培养48 h。

（2）将上述培养好的斜面活化酵母菌种接一环于液体试管中，以28～30  ℃培养24 h。

（3）将上述液体试管酵母接种于小三角瓶中（每支试管接一个三角瓶），以28～30℃培养至对数期末（约16 h）。

3.  种子（酒母）质量要求

对培养好的三角瓶种子要进行质量检查。镜检时要求酵母形态健壮整齐，细胞内原生质稠密，无杂菌，细胞数（0.8～1.0）×10⁸ 个/ML，出牙率20%～30 %，死亡率要小于1 %。

二、淀粉原料的蒸煮与糖化

1.  按甘薯粉或木薯粉的3.5倍量的加水比，用50～55 ℃的温水与淀粉原料搅拌混合，添加原料量0.1%的细菌淀粉酶，于电炉上加热并不断搅拌，升温至90～93 ℃，5～10 min，进行液化；继续加热煮沸1h，使淀粉充分糊化和液化，并适量补充水分。

2.  将上述蒸煮醪冷却至60～62 ℃，添加180 u/g原料的糖化酶，用硫酸将醪液的pH调节至4～4.5，在水浴锅上保温糖化30 min，而后分装于1000 mL的三角瓶中，每瓶装糖化醪500 mL。

3.  糖化醪的质量要求：糖度15～17 °Bx，还原糖6 %～9 %，Ph4～4.5。

三、糖化醪的发酵

将培养成熟的小三角瓶酵母种子（酒母）以无蓖操作接入装有500 mL糖化醪的大三角瓶中（每个小三角瓶中接一个大三角瓶，在30 ℃的温度下发酵68～72h。

四、CO₂生成量的测定

测定乙醇发酵中CO₂生成量的装置如图5-1所示。其测定方法如下：

1.  发酵前，将三角瓶外壁擦干，置于1/100g的大平上称重，记下质量为m₁。

2.  发酵完毕后，将三角瓶轻轻摇动，使CO₂尽量逸出。在同一架天平上再称重，记下质量为m₂。

3.  CO₂生成量＝m₁-m₂。

五、乙醇度的测定

1.  安装好蒸馏装置。

2.  准确量取100 mL发酵成熟醪倒入500 Ml蒸馏瓶中，并加入等量的蒸馏水。蒸馏瓶用插有温度计的胶塞塞紧，连接好冷凝管，勿使漏气。用电炉加热，同时接通冷却气，馏出液收集于100mL容量瓶中（如无容量瓶亦可直接用100 mL量筒收集）。待馏出液达到刻度时，立即停止收集（注意：不能超过刻度），倒入量筒中，稍加搅动，使之均匀，将酒精计与温度计同时置入量筒，测定酒精度与温度。

3.  根据测得的乙醇度与温度，查换算表，得到温度在20 ℃时的乙醇浓度。