多管发酵法测定水中大肠菌群
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多管发酵法测定水中大肠菌群
一、目的要求
1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理
多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1．初（步）发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离
平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、器材
乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；
载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、操作步骤
1．水样的采取
2．自来水检查
（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。
（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养 18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
（a）深紫黑色、有金属光泽。
（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。
（c）淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。
3．池水、河水或湖水等的检查
（1）将水样稀释成10-1 与10-2 。
（2）分别吸取1ml10-2 、10-1 的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有 5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。
（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
（4）将100、10、1、0．1（10-1 ）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0．1（10-1 ）、0．01（10-2 ）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数
五、实验报告
1．结果
（1）自来水
100ml水样的阳性管数是多少？
10ml水样的阳性管数是多少？
查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？
（2）池水、河水或湖水
阳性结果记“ ”；阴性结果记“-”。
查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？
查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？
2．思考题
（1）大肠菌群的定义是什么？
（2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？
