多管发酵法

多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

1. 初（步）发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为 pH 指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

水样接种于发酵管内，37℃ 下培养，24 h 内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到 48 h 后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48 h 后仍不产气的为阴性结果。

2. 平板分离

平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo's medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管 24 h 内产酸产气和 48 h 产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。

3. 复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经 24 h 培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

待检水样
乳糖蛋白胨发酵管 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶） 伊红美蓝琼脂平板 灭菌水
载玻片 灭菌带玻璃塞空瓶 灭菌吸管 灭菌试管

1. 水样的采取（见「水中细菌总数的测定」实验）

2. 自来水检查

2.1 初（步）发酵试验

在 2 个含有 50 ml 三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入 100 ml 水样。在 10 支含有 5 ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入 10 ml 水样（如图 1）。混匀后，37℃ 培养 24 h，24 h 未产气的继续培养至 48 h。

图 1　多管发酵法测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释

2.2 平板分离

经 24 h 培养后，将产酸产气及 48 h 产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于 37℃ 下培养 18～24 h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

2.2.1 深紫黑色、有金属光泽。

2.2.2 紫黑色、不带或略带金属光泽。

2.2.3 淡紫红色、中心颜色较深。

2.3 复发酵试验

经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落 1～3 个， 37 ℃ 培养 24 h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。

证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表 1，即得大肠菌群数。

表1　大肠菌群检表数
接种水样总量 300 ml（100 ml 2 份，10 ml 10 份）

3. 池水、河水或湖水等的检查

3.1 将水样稀释成 10^-1 与 10^-2 。

3.2 分别吸取 1 ml 10^-2 、10^-1 的稀释水样和 1 ml 原水样，各入装有 10 ml 普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取 10 ml 和 100 ml 原水样，分别注入装有 5 ml 和 50 ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。

3.3 以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。

3.4 将 100、10、1、0.1（10^-1）ml 水样的发酵管结果查表 2，将 10、1、0.1（10^-1）、0.01（10^-2）ml 水样的发酵管结果查表 3，即得每升水样中的大肠菌数。

表 2　大肠菌群检数表
接种水样总量 111.1 ml（100 ml、10 ml、1 ml、0.1 ml 各 1 份）

表 3　大肠菌群检数表
接种水样总量 11.11 ml（10 ml、1 ml、0.1 ml、0.01 ml 各 1 份）