正常细胞和肿瘤细胞常规核型标本制备

一、微量全血培养
(一)原理
人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞，正常情况下处于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能使处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。
人体微量全血培养是一种简单的淋巴 细胞培养 方法。此法采血量少、操作简便，在 PHA作用下进行短期培养即可获丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各种因素的效应(如病毒、电离辐射、化学药剂等)也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其它学科研究中的一种有效的方法。
(二)操作
1．打开超净台紫外灯20～30分钟。洗手、换洁净白大衣后进入操作室。启动超净台，点燃煤气灯。用75％酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超净台。
2．在超净台内将每个培养瓶装入5ml培养液及0.2ml PHA溶液，封好备用。
3．用5ml注射器，7号针头，先吸取少许肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血l～2ml。
每个培养瓶接种全血O．2ml左右轻轻摇动使血和培养液混匀。
4．在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中37℃培养。每天轻轻震荡培养瓶二、三次，防止血球沉积并保证血细胞与培养液充分接触，促进细胞生长繁殖。
二、人淋巴细胞染色体标本制备
(一)原理
在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。
(二)操作
1．微量全血 细胞培养 至68小时左右，用1ml注射器 号针头向每个5ml培养瓶内加2滴秋水仙素溶液，摇匀后继续培养3小时，此项操作不需要严格无菌。
2．按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至10ml离心管中。用天平平衡后以1000rpm离心8分钟，弃大部上清，剩0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热37℃的 0.075mol／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低渗处理30分钟(这期间配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。
3.向离心管中加入1ml固定液预固定。平衡后以1000rpm离心8分钟，同样剩 0.5ml上清。
4．轻轻将细胞吹成悬液，加5~6ml固定液，室温下固定30分钟。然后离心，弃上清，重复固定一次。再离心，留0.1～0.2ml上清，吹打成细胞悬液。
5．吸取1～2滴悬液，在距载片约15cm高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干(此期间配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸缓冲液1:10)。
6．将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分钟，自来水冲洗，晾干后观察。
(三)结果
低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互不重叠。
油镜下观察可见每一条染色体都含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区计数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。