人类体细胞染色体标本制备与核型分析
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【实验目的】
1. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。
2. 熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。
【实验原理】
染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此,必须获得染色体标本才能进行检查分析,通常情况下,都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下,人体外周血淋巴细胞不再分裂,但植物血凝素(PHA)可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞,使其恢复增殖能力。
因此,可采取少量外周静脉血,做短期培养,培养至72小时细胞进入增殖旺盛期,此时加入秋水仙素抑制细胞分裂,使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞,经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。
上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后,可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带,表明每条染色体的特征。
【实验用品】
1.采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、 试剂 瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。
2.RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素(500 U/ml)、植物血凝素(PHA)、秋水仙素(10mg/ml)、KCl低渗液(0.075mol/L)、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液(PH6.8)。
3.2.5%胰酶溶液(Hanks液配制)、0.4%酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。
【实验步骤】
一.外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析
1. 采血及接种培养
1.1 在酒精灯火焰上,用灭菌注射器(一次性注射器)抽取肝素0.2ml,使肝素湿润至管壁。
1.2 常规消毒后,采集外周静脉血5ml,转动注射器使血液与肝素混匀。
1.3 在超净工作台中,预先将RPMI 1640液体培养基(5ml,含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清)加入消毒好的小培养瓶中,再滴加25滴全血(6号针头),水平摇动混匀。
1.4 置37℃恒温培养箱中培养72小时。培养过程中每天水平摇动培养物1~2次,使血液均匀悬浮,再继续培养。
1.5 终止培养前2~4小时,加入秋水仙素,使终浓度达到0.2μg/ml。轻轻摇动培养瓶,使秋水仙素混匀。继续培养至72小时。
2.制片
2.1 收集细胞时,去掉瓶塞,用乳头吸管吸取培养液,充分混匀培养物,再将全部培养物吸入刻度离心管中。
2.2 1000 rpm离心8分钟(注意先配平)。
2.3 弃上清液,加入37℃预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml,用吸管轻轻吹打细胞团混匀后,置37℃恒温水浴箱低渗处理25分钟。
2.4 加入 1ml新配制的固定剂(甲醇:冰乙酸=3:1),用吸管小心吹打、混匀,1000rpm离心8分钟。
2.5 弃上清液,加入8ml固定剂,吹打细胞团制成细胞悬液后,室温下固定20分钟。
2.6 1000 rpm离心 8分钟。
2.7 弃上清液,重复固定一次。
2.8 弃上清液,根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂,吹打细胞制成悬液。
2.9 吸取少量细胞悬液,滴2~3滴于冰水浸泡过的载玻片上,吹散,气干。
2.10 将标本置Giemsa染液中,染色8分钟,水洗去浮色,气干。
2.11 显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。
二.人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析
1. G显带染色体标本制备
1.1 常规制片后,将标本置70℃烤箱中干烤2小时,自然冷却。
1.2 取2.5%胰酶溶液5ml,加入染色缸中,加入45 ml生理盐水,用 1N HCl或1N NaOH及酚红调节胰酶溶液成紫红色(PH6.8~7.2),置 37℃预温。
1.3 将玻片标本放入胰酶溶液中处理25~45秒钟,不断轻轻摇动玻片,使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加,胰酶逐渐消耗,胰酶作用时间逐渐延长。
1.4 取出染色体玻片标本,置于37℃预温的生理盐水中,然后用蒸馏水冲洗玻片(或轻甩,除去多余的胰酶)。
1.5 将玻片标本放入37℃预温的Giemsa染液中,染色5~10分钟。
1.6 自来水冲洗,气干。
1.7 显微镜观察。