光谱染色体核型分析

一、探针

已经标记好的商品探针以混合形式溶解在杂交液中。

二、从组织中制备染色体

1.在组织培养用的超净工作台中进行无菌操作，在无菌培养皿中，用刀片将组织切碎成细小的块。

2.将细碎的组织块转入有足够培养基的、具有通气孔的组织培养瓶中；培养基要盖过平面放置的培养瓶底（通常 10~15 mL)。

3.将培养瓶放入 CO2 培养箱中，静置培养 24 h。

4.光镜下观察其生长状态。

5.当达到要求的生长状态或培养时间时，向培养瓶中加入秋水仙胺至终浓度 l(ug/mL，在 CO2 培养箱中继续培养 2~3 h(见注释 1)。

6.将培养基和悬浮的组织或细胞一起转移到 15 mL 锥形底离心管（见注释 2)。对于非贴壁细胞，继续步骤 10。

7.向培养瓶中加入 IOmL 柠檬酸盐溶液，漂洗贴壁的细胞，弃去柠檬酸盐溶液。

8.向培养瓶中加入 10mL 1 X 胰酶。观察贴壁细胞自培养瓶壁上脱离，轻轻吹打，将细胞自瓶壁上吹打下来，转移到 15 mL 锥形离心管中。

9.向含有贴壁细胞的 15 mL 锥形离心管内加入 5 mL 新鲜配置的培基（见注释 3)。

10.1500 g 离心 10min 收集细胞。

11.倒掉或吸出上清，只留下 0.5~1mL 溶液。用手指轻轻敲打管底，打散细胞团。

12.加人预热的 0.075mol/L KCl 溶液，开始的 1mL 逐滴加入，滴加中间混匀（见注释 4); 然后将剩下的 14mL 加入并轻轻颠倒混匀，37°C 放置 10min。

13.加入 5 滴比例为 3:1 的甲醇：冰乙酸，混匀（见注释 5)。

14.1500g 离心 10min。

15.倒掉或吸出上清，打散细胞团（见注释 6)。加入新鲜配置的甲醇：冰乙酸（3:1) 固定液 15 mL，用上述的方法开始的 ImL 逐滴加入，滴加中间混匀；然后加入剩余的 14 mL 固定液，并轻轻颠倒混勻。

16.1500 g，离心.10min。

17.重复步骤 15 的固定。然而，最初的 1mL 不需要逐滴加人。离心，重复固定 3 次。

18.细胞悬液可以以固定液中细胞团的状态 -20°C 保存。

19.为了进行染色体标本制备，倒掉固定液，重悬细胞团块，加入适量的新鲜固定液使悬液轻度浑浊。

20.用 200ul 的枪，吸取 100ul 悬液，滴到干净的载玻片上（见注释 7)，室温下晾干并储存片子。滴好的片子至少自然老化 2d 或 37°C 过夜老化。

三、染色体标本预处理和变性

1.染色体标本至少自然老化 2d 或用前 37°C 过夜。

2.染色体标本在系列乙醇（70%、80% 和 95%) 中分别脱水 5 min，晾干。

3.加入 15~20uL 的 10% 胃蛋白酶储存液（见注释 8) 到 50 mL 预热的 O.Olmol/L HCl 中，将染色体标本在 37°C 染色缸中温育 5 min(见注释 9)。同时，准备一缸 70% 甲酰胺/2 X SSC 溶液并放入 75°C 水浴中预热。

4.取出标本，在室温下的 1 X PBS 中漂洗 5 min。

5.在 1 X PBS/MgCl2 室温温育 5 min。

6.向 50 mL l X PBS/MgCl2 中加入 1.5 mL37% 甲醛，在室温下的该溶液中温育标本 10min(见注释 11)。

7.在室温中的 1 X PBS 中漂洗 5 min。

8.按步骤 2 中所述方法再次进行系列乙醇脱水。

9.晾干片子后，检查甲酰胺溶液的温度是否达到 75°C(见注释 11); 将染色体标本在 75°C 甲酰胺溶液中变性 2 min。

10.迅速将标本转移到冰冷的 70% 乙醇中并用系列乙醇脱水（见注释 12) 后晾干。

四、探针变性

1.对于每张标本，22 mm X 22 mm 盖玻片的范围内需要用 10uL 探针；如果该区域大于此范围，增加探针的使用量。取适量的探针到一个 Eppendorf 管中。

2.在水浴锅或 PCR 仪上 75°C 热变性探针 10min。

3.将探针于 37°C 水浴中预复性 lh。

五、杂交

1.从 37°C 中取出预复性的探针，小心的加到变性的中期染色体标本上。因为探针既有直接标记又有间接标记，应迅速操作并避免长时间暴露在光线条件下。

2.小心的盖上盖玻片，注意不要产生气泡。如果出现气泡，轻按盖玻片，将气泡挤出。

3.用橡皮泥封好盖玻片边缘。

4.放入杂交盒（见注释 13)，并放入塑料袋中（可选择的），在 37°C 条件下杂交 48 h。

六、杂交后洗脱和检测

1.在 45°C 水浴中预热所有的溶液。

2.从杂交盒中取出片子，小心除去橡皮泥。盖玻片也许随橡皮泥一块揭去或仍留在片子上。如果盖玻片留在片子上，直接将标本放入第一缸洗脱液。

3.在 50% 甲酰胺/2 X SSC 中洗 3 次，每次 5 min。在第一次洗脱时盖玻片应滑掉。轻轻振荡染色缸几秒钟（见注释 14)。

4.在 1 X SSC 中洗片 3 次，每次 5 min 并轻轻振荡。

5.标本浸在 0.01%Tween-20/4 X SSC 中，取出标本，甩掉多余的液体，但保持片子表面湿润。

6.取 30~40uL SKY 试剂盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 2 中的封闭液加到标本上，盖上盖玻片。

7.将标本放回杂交盒，37°C 温育 30 min。

8.小心移开盖玻片，取 30~40pLSKY 试剂盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 3 中的检测溶液加到片子上，并盖上盖玻片。

9.将标本放回杂交盒，37°C 温育约 30 minD

10.小心移开盖玻片，在 0.01%Tween-20/4XSSC 中洗 3 次，每次 5 min。轻轻振荡。

11.甩掉多余的液体，取 30~40ul SKY 试剂盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 4 中的检测溶液加到标本上，盖上盖玻片。

12.将标本放回杂交盒，37°C 温育 30 min。

13.小心移开盖玻片，在 0.01%Tween-20/4XSSC 中洗片 3 次，每次 5 min。轻轻振荡。

14.在室温下的 2XSSC 中漂洗片子。

15.用 15~20 斗瓶 5 中的 DAPI/抗淬灭剂封片，盖上盖玻片，避免产生气泡。

16.可以进行阅片。标本应在一 20°C 保存。

七、图像抓取

1.尽可能及时的进行图像抓取和分析。尽管荧光素在一 20°C 并尽可能少的光线条件下能保存几个月，但随着时间的延长，信号强度会减弱（见注释 17~20)。

2.在实验室安装系统时进行用该系统抓取图像和分析的培训。

八、用 SKY 探针与曾 G 显带过的中期染色体标本的杂交：标本预处理

1.在室温下的二甲苯中洗 2 次，每次 5 min，除去 G 带标本上残留的镜油 (见注释 15)。

2.将标本浸在甲醇中 10~15 min 褪色，或直到标本完全褪色。

3.标本褪色后，进行系列乙醇再水合：95%、80% 和 70% 乙醇，每次 5 min，瞭干。

4.继续从本章 3.3 的步骤 5 开始。

5.如果标本曾显带过，在 70% 甲酰胺/2 X SSC 中变性时间需调整以反映标本特性（见注释 16 和表 1)。保守变性时间为 40s。