从逆转录病毒载体的发展谈基因治疗的前景

丁召兴1 　田洪根2
1. 滨州医学院附属医院 256603 2. 滨州市药品检验所 256618

[ 摘要 ] 从逆转录酶和前病毒学说的创立，逆转录病毒逐渐从一种致瘤病毒发展至作为基因转移的载体用于基因治疗的研究 , 医学科学的进步正在使看似不可能的事情变为现实。然而，目前国内外仍不能找到一种满足临床治疗需要的兼顾安全与高效的载体系统，这也使得基因治疗的进程举步维艰。随着科学的发展，可试用的构想不断产生，相信人类终将攻克难关，使基因治疗造福于人类。 载体、转导基因、靶细胞是基因疗法的基本组成元件，基因治疗是将外源性目的基因导入体细胞以纠正遗传或获得的基因缺陷。将目的基因导入靶细胞实现基因治疗的过程中，载体起着至关重要的作用。自从 1990 年开始了世界上首例基因治疗以来，这一曾被奉若神明的科学新贵的发展并非一帆风顺，而是屡遭挫折，人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。事实上，各种类型的基因转移载体在安全性和有效性的问题上不能满足人类顽症基因治疗的需要，其中应用最多的逆转录病毒载体系统的完善，无疑依赖于基础研究的突破。

1. 常用基因转移载体的特点及缺陷
1.1 逆转录病毒
逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是基因组 DNA 中整合了逆转录病毒结构基因的包装细胞。二者功能互补，产生具有感染力的假型病毒颗粒，将含有假病毒颗粒的包装 细胞培养 上清感染相应的靶细胞，实现目的基因与靶细胞染色体 DNA 整合，达到基因治疗的目的 [1] 。逆转录病毒的结构和功能早已被人类熟知并掌握，它的 生物 学特点决定了它可以作为基因治疗中有效的基因转移载体 , 并有基因表达持久而稳定的优点。其主要缺陷是（ 1 ）只能感染分裂期细胞，一旦产生可复制的病毒将非常危险；（ 2 ）与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因损伤。 Mar ia 等人经过实验提出转移基因的突变发生率在真核细胞中虽然极低，但因此而忽略该系统的危险性并不可取 ［ 2 ］ 。一个点突变会给人类带来什么样的后果，在实际的基础实验和临床试验中应该引起人类足够的重视，否则片面夸大有效性，忽视安全性将是有悖于基因治疗造福人类的最终目标的。
1.2 其它载体
除逆转录病毒外，腺病毒载体介导基因转移也颇受重视，它具备体外稳定、易于纯化的优点，能够转染终末分化细胞，不整合入宿主，避免了插入突变的可能。其危险性在于（ 1 ）与细胞基因的重组，使腺病毒结构蛋白表达，引起机体免疫反应；（ 2 ）某些情况下少量的复制能力，使宿主有潜在发生脑炎的危险。在非病毒载体中应用最广的是脂质体，具有低毒、稳定、不整合、不繁殖，目的基因短暂表达的特点。主要缺陷：（ 1 ）长期存在可导致基因整合突变；（ 2 ）血清载脂蛋白与脂质体相互作用，脂质体膜通透性增大，最终破裂引起机体毒性反应 [3] 。由此可见，各种类型的载体均无法达到人类对其用于基于治疗所寄予的厚望。当然，起主导作用的逆转录病毒正在不断完善，其重组的载体形式不断克服种种弊端，介导基因转移初见成效。

2. 逆转录病毒载体的重组及改造以适应基因治疗的需要

2.1 基因转导的安全性问题　
在实施基因治疗的初期，社会公众就对其安全性和必要性提出过种种非议：作为载体的病毒会不会重组出新的高传染性疾病？通过病毒将外源基因携带入人体，会不会在人体发挥应有的正常作用？会不会干扰人体正常的基因活动？会不会使肿瘤发生的危险性增大？人类盲目地导入或去除自身遗传成分，是否会危及人类的生存 [4] ？面对人类的猜疑和困惑，这些问题也日益受到科学家的重视。通过严格控制操作条件和规程，将原病毒的结构基因分开置于两个病毒基因中，大大降低了逆转录病毒与辅助病毒基因组的同源性，基本排除了产生可复制的野生型病毒的可能。况且，用于人体治疗的逆转录病毒上清液及产生病毒的细胞或接受介导的基因转导细胞在输入人体前都要作病毒扩增预试验 , 以检测有无病毒的自身繁殖。那么，病毒与宿主细胞染色体基因组的随机整合究竟会不会或者会造成多大的不良后果呢？据 Temin 估计，由外源基因整合造成抑癌基因破坏的概率为 10 ^-3 ～ 10 ^-6 ，由于逆转录病毒对每个靶细胞基因组都只整合单拷贝，不可能同时破坏靶细胞中二倍体的抑癌基因，致瘤可能性极小，由其插入导致原癌基因激活的概率也仅为 10 ^-6 。在目前已经进行的动物实验和临床试验及治疗中，尚未出现由于逆转录病毒插入突变引起器官病变及恶性肿瘤发生的现象 ［ 1 ， 3 ］ 。当然，在用基因治疗纠正疾病缺陷时，其安全性研究及评价也就成为人类普遍关注且迫切需要解决的问题。
2.2 基因转导的靶向性问题　
为了实现特异性基因治疗的目的，近年来大量研究针对如何增强基因治疗的特异性从基因导入水平、表达水平及基因产物作用水平进行了尝试，并产生许多令人振奋的结果。（ 1 ）利用抗体与抗原、配体与受体的特异结合能力，使载体与特异的靶细胞结合。病毒载体的宿主细胞范围是由病毒衣壳上的蛋白质成分决定的，将能与某种类型细胞上特有的受体或抗原结合的配体或抗体插入天然的包膜受体结合区形成嵌合蛋白并赋予特异性，分两步完成病毒与靶细胞的结合和融合。（ 2 ）将组织或细胞特异性的启动子与无启动子的外源基因编码序列组合成嵌合基因，实现该基因的特异性表达，典型如肝癌细胞特异性甲胎蛋白 AFP 启动子，黑色素细胞特异性酪氨酸酶启动子等 [5] 。改建后的逆转录病毒载体携带治疗基因可定向感染靶细胞或在特定细胞内实现转导基因的表达，从而增强基因治疗的特异性，这也是决定基因治疗最终造福于人类的关键因素之一 . 实际应用中把这些尝试应用于临床也不可免的面临许多问题，仍需进一步改进和修饰以满足治疗的需要。