慢病毒载体是近几年发展起来的新型转基因载体。慢病毒属逆转录病毒的亚科，慢病毒载体经结构改造后，不在宿主细胞内增殖，也不会导致寄主细胞的死亡，受感染动物细胞能正常连续传代，其最大的优势在于既能感染静细胞也可感染分裂期细胞，而且感染率极高。

器材：

①T150 瓶、培养皿

②显微镜

③离心机

④37 ℃，5％CO₂ 培养箱

⑤FACS9 流式细胞分析仪

⑥Mierolodder（Eppendorf）

⑦自制玻璃毛细管

试剂：

①293 FT 细胞

②高糖 DMEM＋10％FBS，1％Glutamax＋1％（青霉素-链霉素）

③氯喹（chloroquine）、Na₂ HPO₄

④M2 培养液、M16 培养液

⑤Hepes、HBSS（Invitrogen Cat．No．：14025-092）、PBS

⑥胰酶-EDTA 溶液

重组逆转录病毒（慢病毒）载体感染制备转基因动物的基本过程可分为如下几步：

一、重组慢病毒载体的构建

重组慢病毒载体一般来自对天然慢病毒基因组（如 HIV-1 基因组）的改造。常用的慢病毒载体一般情况下已完全剔除了原慢病毒基因组中所有的结构蛋白基因，保留了可提高原病毒整合率以及病毒滴度的 DNA 顺式作用 Flap-1，并加入了来自 Wooduck virus 基因组、可提高转基因表达水平的基因表达转录后调控元件 WPRE；此外，还删除了病毒载体 3＇LTR 中的 U3 区域的部分序列，导致病毒基因组逆转录为 provirus、整合至宿主细胞基因组后，其 LTR 序列自动失去启动子活性（self-inactivation），由此可插入外源性的组织或器官特异性启动子，实现目的基因的组织或器官特异性表达。

二、重组慢病毒的包装

（一）接种 293FT 细胞作为慢病毒载体的生产细胞

1．在 T150 瓶内接种 293 FT 细胞培养至 50％ 融合，所用培养基为：高糖 DMEM＋10％FBS，1％Glutamax＋1％（青霉素-链霉素）。

2．分离 T150 瓶内的 293FT 细胞，并将细胞悬液分装至 12 个 10 cm 细胞培养皿中（细胞数量约 1x108～109 个／平皿），每个培养皿内含 25 mL 的与上步相同的高糖 DMEM 培养基。

（二）将慢病毒载体质粒及其包装质粒 psPAX2 和 pMD2 G 同时转染 293FT 细胞，实现病毒包装

1．显微镜下检查接种的细胞，当细胞呈现 60％～80％ 的汇合、贴壁良好分布均匀，即可用于转染。

2．加 25 μl 25 mmol／L 氯喹（chloroquine）到每一个培养皿中，使最终的浓度为 25 μmol／L。

3．在 5 ml 离心管中，用无菌去离子水将 72 μg 质粒 pMD2．G、180 μg 质粒 psPAX2 和 240 μg 质粒 FUCW 混合，并定溶至终体积 13.14 mL，之后加入 1.8 mL 的 2mol／LCaCl₂。

4．充分混匀上步混合溶液，并等分出 1.25 mL 混合液至 12 个无菌的 5 mL 圆锥形离心管中。

5．用 5 mL 移液管，在上步分装的混合液中逐滴加入 1.25 mL 2xHBS（280 mM NaCl，10 mM KCI，1.5 mMNa₂ HPO₄,12 mM 蔗糖，50 mM Hepes，pH 7.00～7.45）并轻轻涡旋（保证试管内足够的混匀），获得 DNA-磷酸钙复合物（注意：2xHBS 的适当配制和保存非常重要）

6．滴加完毕后静置 1～2 分钟，待磷酸钙沉淀形成，之后将步骤 5 形成的 2.5 mL 混合物轻轻滴加到培养 293 FT 细胞的 10 cm 培养皿中。

7．重复步骤 5 和 6，将 DNA-磷酸钙混合物滴加在其余 11 个养有 293FT 细胞的 10 cm 培养皿中。

8．将 12 个培养皿转移至细胞培养箱中，在 5％CO₂,37 ℃ 下培养过夜（16～18 小时）（注意：放置时确保培养皿平衡叠加，每叠最多不要超过 6 个）。

9．通过抽吸移走培养基，并加入 17 mL 新鲜的高糖 DMEM（含 10％FBS，1％ 谷酰胺和 1％ 青霉素-链霉素），在 5％CO₂,37 ℃ 条件下继续培养 48 小时。

（三）病毒的收集与浓缩

1．在显微镜下观察转染细胞。融合细胞的合胞体应当开始出现，大多数细胞应当仍然具有黏附能力。如果有报告基因编码荧光蛋白（如 EGFP），将会看见超过 95％ 的细胞显示荧光（图 5-1-42）。

2．用 50 mL 尖底离心管收集细胞上清，并在 25 ℃，500 g 下离心试管 10 分钟以去除细胞和大的细胞碎片，并用 0.45 μm 滤器将离心后的上清过滤到另一干净的 50 mL 尖底离心管中。

3．以 20000 g 离心 6 小时（或 70000 g 离心 2 小时）（为了提高滴度，可以将 100 mL 上清连续两次在同一 50 mL 离心管中离心，弃去上清，确定沉淀所在位置。

4．用 200 ul HBSS（Invitrogen Cat．No．：14025-092）重悬沉淀 先用 100 μl 充分重悬后，再用另外 100 μl 漂洗离心管，并两部分悬液混合。

5．取 1.5 mL 离心管，加入 400 μl 含 20％ 蔗糖的 HBSS 缓冲液，之后将病毒悬液加在 HBSS 缓冲液液面之上，4 ℃、50000 g 离心 2 小时。

6．弃上清，用 70 μl HBSS 重悬沉淀，4 ℃、12000 g 离心 10～30 秒，分装上清，置于-80 ℃ 保存。

（四）病毒滴度的测定

1．在 6 孔板中每孔接种 5x10 个的 293 FT 细胞。

2．在接种有 293 FT 细胞的 6 孔板中每孔分别加入稀释 1000 倍的病毒液 2 μl、5 μl、10 μl、100 μl、200 μl、500 μl（稀释的最终倍数根据流式细胞计的结果随时调整，以获得线性最好的结果，以相对准确地计算病毒滴度）。

3．感染 48 小时后，用 2 mL 新鲜的培养基代替，继续培养细胞 48 小时。

4．移走培养基，用 1 mLPBS 洗细胞 2～3 次，之后每孔加入 0.5 mL 胰酶-EDTA 溶液，在 37 ℃ 孵育 2 分钟。

5．每孔加入 1 mL 培养基并混合均匀以终止消化，并将细胞悬液从每一个孔中转移至 5 mL 尖底试管中，在 20 ℃ 下 500 g 离心 5 分钟，得细胞沉淀。

6．丢弃培养基，用 2 mL Hanks 平衡液重悬细胞，并在 20 ℃ 下 500 g 离心 5 分钟获得细胞沉淀；之后丢弃上清，用 300 μl Hanks 平衡液重悬细胞。

7．利用 FACS9 流式细胞分析仪分析绿色荧光细胞的百分比。

三、通过卵周隙显微注射实现重组慢病毒对早期胚胎的感染

1．动物早期胚胎的获取、收集。

2．取胚操作完成后，用 10 μlM2 培养液在凹玻片上制备一扁平的液滴，上覆液体石蜡，并置于 CO₂ 培养箱中温育平衡。

3．注射前解冻病毒液，4 ℃、12000 r／min 离心 1 分钟。

4．用 Mierolodder（Eppendorf）从注射针尾端进入，到达针尖后装入少量病毒液。

5．用自制玻璃毛细管在注射针中加入液体石蜡、排出注射针内的空气，且病毒液与液体石蜡之间气体。

6．将持卵针和注射针分别安装于显微操作系统的左、右操作臂上，并与显微注射仪连通，调整至合适的高度和角度。

7．用持卵针吸入 2／3 长度的 M2 培养液，前端不留气泡。

8．取出凹玻片，在微滴中装入 50～80 枚排出极体、并且雌雄原核清晰的胚胎，置于倒置显微镜载物台。

9．注射针刺入第一个胚胎前，先在持卵针顶端轻轻触碰以打开尖端，排出顶端的少量气体，调整注射针内的压力，在镜下用注射针对准胚胎，若胚胎移动即说明尖端打开。

10．注射针从 3 点钟方向刺入胚胎上（或下）半部分的透明带，见卵周隙变大、透明带变薄立即抽出注射针（图 5-1-43a，b），然后用持卵针吸取下一枚卵注射。

11．液滴内的胚胎注射完毕后，移回 M16 培养液滴中培养，进行下一批注射。