蛙骨髓细胞染色体玻片标本的制作

一、实验目的
1、了解动物细胞染色体制片的原理。
2、学习蛙骨髓细胞染色体制片的方法。
3、观察蛙染色体的数目和形态。
二、实验原理
小型动物染色体制片最好、最有效的材料就是骨髓组织。在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，可直接得到中期细胞。为提高有丝分裂指数，实验前，于动物腹腔内注射一定量的秋水仙素溶液，取骨髓后，经低渗处理、固定、滴片、空气干燥后即可获得良好的中期分裂相。
三、实验材料、
蛙类
四、器具及药品
注射器， 离心管 、解剖器、离心机，冰箱、电子天平，显微镜，搪瓷缸，载玻片，烧杯，滴管，秋水仙素，KCl，甲醇、冰乙酸，乙醇。
五、实验步骤
㈠离心法（适合于个体大的蛙）
1、前处理
   目的：改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤体的形成，使染色体缩短和分散，获得较多中期分裂相。
实验前8-20小时，将蛙称重，按每克体重10-40ug的剂量（无尾类10-20ug，有尾类30-40ug）经腹腔注射秋水仙素溶液，秋水仙素溶液浓度100-1000ug/ml，按蛙大小来配。
2、取骨髓细胞
   将蛙麻醉，用手术剪剥开腹腔，取下四肢骨，剔净肌肉，放到盛有0.046mol/l的KCl的小烧杯中洗一下，用镊子夹出来，剪掉两端关节，将装有0.046mol/l的KCl的注射器从骨一头插入，冲骨髓细胞于干净的 离心管 内，反复冲洗几次，直到骨变白为止。注意这一过程不要让组织块掉入离心管。
3、低渗处理
   目的：使细胞吸水膨胀，细胞膜易破裂，有助于染色体的分散。
   当骨髓细胞全部冲入离心管后，开始计时，即低渗开始。室温下低渗处理30-40分钟，在此过程中，要用吸管反复吹打。
   另外取预先洗净的载玻片放入盛有蒸馏水的搪瓷缸中，置冰箱中冰冻。
4、固定
   目的：尽快杀死细胞，使细胞尽可能保持原有的状况，并且还可以去掉细胞质。
   将离心管两两平衡后，对称放入 离心机 内，以1000转/分离心10分钟，轻轻取出，弃上清液，沿管壁缓慢加入现配卡诺氏固定液6ml左右，并用吸管吹散细胞团，固定30分钟，平衡后再离心，弃上清液，加卡诺氏固定液进行第二次固定。
注意，固定液要现配，每次离心前都要平衡，离心的时间、速度均同第一次。由于每离心一次，细胞要损失30％左右，因此对个体小的蛙第二次固定也可省去，但固定次数少，细胞质不易去掉，影响效果，固定次数多，离心后细胞损失多。这一茅盾的解决有待多次实验的摸索，原则上大型蛙可固定2-3次，小型蛙1次。