T、B淋巴细胞分离试验

淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。
材料及 试剂 ：
a)新鲜豚鼠血
b)兔红细胞（RRBC）
c)溴花二氨基异硫氢化物（AET）
d)淋巴细胞分层液
e)其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。
方法：
1.AET—RRBC制备
（1）.AET溶液的制备
称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4NNaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。
（2）.AET处理RRBC
取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至 离心管 口（1—2厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。
（3）.1%AET—RRBC的配制：
将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。
2.从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。
3.AET—E花环试验：
将分离的单个核细胞（2ⅹ106/毫升）与等量1%AET—RRBC混合，置37℃ 水浴 15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。
4.T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离
将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。